多组学剖析揭示GNA15过表达肿瘤簇在三阴性乳腺癌中的不良预后作用及机制

本综述通过整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）和 bulk RNA测序数据，系统解析了三阴性乳腺癌（TNBC）的肿瘤异质性，鉴定出与不良预后相关的S2肿瘤细胞簇，并证实G蛋白亚基α15（GNA15）作为其核心基因通过MAPK信号通路驱动TNBC进展，为靶向治疗提供了新策略。

　　

引言

乳腺癌数十年来一直是全球女性癌症相关疾病的首要原因。作为一种异质性疾病，其高度异质性导致治疗反应、复发模式和转移潜能的差异。三阴性乳腺癌（TNBC）缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和Erb-B2受体酪氨酸激酶2（HER2）的表达，治疗选择主要限于化疗。作为乳腺癌中最具异质性的亚型，TNBC表现出比其他亚型更具侵袭性的生物学行为，导致预后较差和较早转移。因此，表征TNBC的瘤内异质性和疾病进展过程对于改善TNBC患者的预后至关重要。

方法

本研究纳入了四个公共数据集：三个scRNA-seq队列和一个bulk RNA测序队列。从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库获取了15个TNBC scRNA-seq图谱，而bulk RNA-seq图谱和相应的临床信息则从The Cancer Genome Atlas（TCGA）获得。使用“Seurat”包进行单细胞矩阵表达谱的标准化，采用严格的质量控制标准纳入高质量单细胞进行后续分析。使用“Doubletfinder”包去除潜在的双细胞，利用“Harmony”包消除样本间的批次效应。通过“infercnv”包进行拷贝数变异（CNV）分析以从总上皮细胞中识别恶性细胞。使用“GeneNMF”包识别肿瘤细胞的元程序（metaprogram），通过pySCENIC进行转录因子分析。利用“Vector”包推断细胞发育起源，使用slingshot方法分析伪时间细胞轨迹。通过“CellChat”包研究细胞类型间的细胞-细胞通信，利用“hdWGCNA”包构建加权基因共表达网络分析（WGCNA）。进行体外实验验证，包括RT–qPCR、CCK-8测定、集落形成测定、细胞划痕测定和Transwell侵袭测定。

结果

TNBC肿瘤微环境景观的表征

研究整合样本后构建了一个大型单细胞矩阵，消除了样本间的批次效应。预处理后，共获得54,867个细胞和29,259个特征进行进一步分析。 delineate了24个细胞簇，使用已建立的标记物注释了九种主要细胞类型：循环细胞、B细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、T/NK细胞、平滑肌细胞、浆细胞和髓样细胞。缺乏明确标记物的细胞被指定为未定义。UMAP可视化证实了不同细胞类型的稳健分离。细胞比例表征显示，不同样本间TNBC的肿瘤微环境高度异质。

恶性细胞鉴定

上皮细胞被广泛认为是乳腺癌细胞的起源。然而，仅通过生物标志物表达在单细胞分辨率下区分肿瘤细胞与上皮群体仍然具有挑战性。因此，使用“infercnv”包推断每个样本的肿瘤细胞。上皮细胞相对于髓样参考细胞表现出显著的染色体扩增和缺失。计算CNV相关性和CNV评分以识别恶性细胞。基于这些结果，上皮细胞中的肿瘤细胞被定义为CNV评分 > 0.001且CNV相关性 > 0.5，而CNV水平与髓样细胞相似的上皮细胞被定义为正常上皮细胞。最终，分离出14,335个肿瘤细胞进行下游分析。

TNBC微环境中肿瘤细胞异质性的表征

肿瘤异质性影响肿瘤的生物学行为、治疗反应和预后。因此，解析肿瘤细胞异质性对于推进TNBC精准医疗至关重要。在高置信度恶性细胞识别后，使用已建立的方法整合、重新标准化和降维肿瘤细胞。解析了六个肿瘤簇：S0、S1、S2、S3、S4和S5。转录因子（TF）分析确定了每个亚组中前10个最活跃的TF，揭示了显著的簇间异质性。例如，TEAD4和ETV在S1簇中表现出高活性，表明该簇可能与干细胞样乳腺癌相关。此外，FOXO1、TEAD1和SMAD3在S2簇中显示高活性，提示S2簇可能与更具侵袭性的生物学行为相关。这些发现证明了TNBC亚群间内在的转录异质性。

接下来，构建了稳定的元程序（MP）以进一步探索肿瘤簇的异质性。识别了六个元程序（代表协调的生物学程序）。具体而言，MP2与肿瘤转移（上皮-间质转化）相关，而MP5和MP4与细胞增殖（E2F靶点、G2M检查点、MYC靶点和p53通路）相关。MP3与肿瘤微环境形成（血管生成）相关，MP6与免疫反应（干扰素-γ反应、TNFA信号传导和IL6–JAK–STAT3信号传导）相关。有趣的是，MP1的基因未在任何通路中富集。值得注意的是，观察到MP2特征评分在S1和S2簇中较高，表明这些簇可能促进肿瘤转移。此外，肿瘤增殖相关的元程序MP5特征评分在S1、S2和S3簇中较高。然而，另一个肿瘤增殖相关的元程序MP4特征评分在S3和S4簇中较高。这表明TNBC微环境内存在异质的增殖机制。总之，这些分析阐明了肿瘤亚群间的功能分歧及其机制驱动因素，为靶向治疗开发提供了框架。

肿瘤细胞轨迹的表征

肿瘤细胞的可塑性是其适应微环境变化的重要特征。因此，我们试图重建跨肿瘤簇的发育谱系。首先，伪时间排序推断了细胞起源，确立S3簇为推定的根状态。细胞轨迹分析显示了两个潜在的细胞谱系。具体而言，S3簇可能是肿瘤细胞的初始状态，而S4和S1簇可能是肿瘤细胞的中间状态。不同的是，S0和S5簇是谱系1的最终状态，而S2簇是谱系2的最终状态。

使用TCGA-BRCA队列进行的预后验证表明，根S3簇表现出良好的生存率，而终端S2簇显示出显著较差的结局。这证实了我们轨迹模型的临床相关性，并将S2定位为高优先级治疗靶点。S2簇的不良预后作用也在METABRIC队列中得到验证。因此，有必要探索S2簇的潜在生物学功能。分析了每个簇的顶部标记基因以及相关通路。GO和KEGG分析表明，S2簇与细胞生长、MAPK信号通路、癌症通路、细胞外基质（ECM）受体相互作用和焦点粘附相关，表明S2簇可能通过增殖、转移和微环境重塑机制驱动肿瘤进展。总之，我们确立S2为TNBC侵袭性的关键驱动因素。

TNBC肿瘤微环境中肿瘤簇与其他组分间的细胞-细胞通信

肿瘤簇与其他组分间的相互作用已被证实在肿瘤进展中起关键作用。除了内在进化外，我们假设S2簇行为可能受到外在因素的调节。使用“CellChat”包评估了TNBC肿瘤微环境中的相互作用和强度。注意到成纤维细胞与S2簇之间存在显著的相互作用。结合先前的KEGG结果，我们关注成纤维细胞与S2簇间ECM相关的配体-受体对的相互作用。成纤维细胞和S2簇在胶原蛋白和FN1通路中表现出明显的富集。关键的胶原蛋白配体-受体对（COL1A2-CD44、COL1A2-SDC4、COL1A1-SDC4和COL1A1-CD44）表现出高通信概率。类似地，FN1对（FN1-CD44和FN1-SDC4）显示出升高的相互作用可能性。成纤维细胞作为信号起始者，高表达配体COL1A1、COL1A2和FN1。相反，S2（信号接收者）高表达受体CD44、SDC4、ITGAV、ITGA2和ITGB6。值得注意的是，CD44、ITGAV、ITGA2和SDC4被证实是PI3K/AKT或MAPK通路的上游。这些结果揭示了肿瘤簇与癌症相关成纤维细胞（CAFs）之间的潜在分子机制。这些结果阐明了一个分子机制，即癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过ECM受体信号传导调节S2簇，协同促进超越内在进化轨迹的恶性表型。

S2簇的Hub基因识别

鉴于S2簇在TNBC肿瘤微环境中的关键作用，识别治疗靶点对于改善患者结局至关重要。我们构建了一个高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）以使用单细胞RNA表达谱识别簇特异性共表达基因。网络在软阈值功率为9时达到最佳连接性。解析了19个共表达模块，每个模块的前10个hub基因被编目。使用Ucell包计算的模块特征评分显示，模块3和9 specifically在S2簇中显著富集，表明它们的基因代表了这个侵袭性亚群的hub候选基因。UMAP可视化和小提琴图证实了这些发现。总之，我们为S2簇识别了271个hub基因。通过将这些与先前的转录因子分析整合，我们为这个亚群构建了一个全面的分子调控网络。这些结果为阐明TNBC肿瘤细胞异质性和推进靶向治疗建立了一个框架。

GNA15被识别为S2簇的关键基因

为了识别TNBC的治疗靶点和生物标志物，我们通过顺序过滤细化候选基因以确立核心驱动因素并验证分析准确性。差异基因分析揭示了相对于正常乳腺组织过表达的TNBC基因。随后的生存分析识别了与不良预后相关的基因。过表达基因、模块相关基因和生存相关基因的整合 pinpointed GNA15 作为S2簇核心基因。升高的GNA15表达与显著较差的总生存期相关。