急性视神经脊髓炎谱系障碍患者T淋巴细胞亚群动态变化及其临床意义研究

本研究发现急性期NMOSD患者存在显著的T淋巴细胞亚群失衡，特别是Th1Th17细胞频率升高和CD8+TEM细胞减少。研究通过多色流式细胞术揭示糖皮质激素治疗对T细胞活化标志物（HLA-DR+/CD38+）的调控作用，为靶向Th17细胞（如IL-17抑制剂）和T细胞活化（如HLA-DR靶向治疗）提供了新的免疫干预策略。

　　

1 引言

视神经脊髓炎谱系障碍（NMOSD）是一种罕见的自身免疫介导的中枢神经系统脱髓鞘疾病，以靶向星形胶质细胞水通道蛋白-4（AQP4）的致病性抗体为特征。该病临床表现包括视神经炎、纵向延伸性横贯性脊髓炎、极后区综合征和急性脑干综合征。流行病学显示NMOSD存在显著的地理和种族差异，全球发病率范围为0.037-0.71/10万人年，患病率介于0.7-10/10万人年，女性患病率是男性的两倍以上。疾病呈复发性病程，伴随累积性、不可逆的残疾进展，阐明其免疫致病机制对开发新型治疗策略至关重要。

NMOSD的免疫发病机制涉及体液免疫和细胞免疫的复杂相互作用。在AQP4-IgG血清阳性患者中，外周活化的浆细胞产生致病性自身抗体，这些抗体通过受损的血脑屏障进入中枢神经系统。AQP4-IgG抗体通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）引发星形胶质细胞损伤，进而导致少突胶质细胞损伤和脱髓鞘。T淋巴细胞通过促进B细胞活化、分化和抗体生产在这一过程中发挥关键作用。小鼠模型实验表明，即使缺乏AQP4-IgG，AQP4反应性T细胞也能诱导NMOSD样病理，凸显其自主致病潜力。

CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞根据CD45RA和CCR7表达谱可分为功能不同的亚群：初始T细胞（TN）、中央记忆T细胞（TCM）、效应记忆T细胞（TEM）和终末分化效应记忆细胞重新表达CD45RA（TEMRA）。初始T细胞（TN）可迁移至次级淋巴器官的T细胞区寻找抗原呈递树突状细胞。抗原接触后，它们被激活并开始增殖。研究发现，与健康对照组相比，NMOSD和多发性硬化（MS）患者的CD8⁺TN（CD62L^hiCD45RO^-）细胞频率显著降低，而CD8⁺TE/M（CD62L^loCD45RO⁺）细胞频率显著增加。接受免疫治疗的NMOSD患者中，CD8⁺TN频率增加，CD8⁺TE/M频率降低。此外，MS患者表现出与年龄相关的活化（HLA-DR⁺CD38⁺）和细胞毒性CD4 T细胞异常增加。然而，这些在NMOSD患者中鲜有报道。辅助T淋巴细胞（Th）细胞，尤其是Th17细胞，在免疫相关神经系统疾病中逐渐引起关注。

为更好描述急性NMOSD发作期间T淋巴细胞动态并识别潜在治疗靶点，我们对急性发作患者进行了免疫学分析。

2 方法

2.1 患者与对照组

本研究招募了2024年1月至2025年5月期间在天津医科大学总医院神经内科住院的急性期NMOSD患者。纳入标准：1. 诊断为NMOSD；2. 急性期定义为新发或复发的神经系统症状持续至少24小时，无发热、感染或其他自身免疫性疾病，症状从本次发病到入院期间持续或恶化；3. 自本次发病以来未接受免疫调节治疗（如利妥昔单抗、托珠单抗、英夫利昔单抗等）。排除标准：1. 妊娠或哺乳期；2. 活动性感染；3. 严重肝肾功能障碍、凝血功能异常、肿瘤病史；4. 目前参与其他临床试验。未接受糖皮质激素治疗的NMOSD患者被分配到糖皮质激素治疗前组（PRE），而接受一周糖皮质激素治疗的患者被纳入糖皮质激素治疗组（GC）。从医院健康体检中心招募年龄和性别匹配的健康对照组。纳入标准：无免疫系统相关疾病、无肿瘤病史、无严重凝血功能异常、无器官功能障碍（肝功能障碍、肾功能障碍等）、无免疫抑制剂使用史。排除标准：1. 妊娠或哺乳期；2. 活动性感染；3. 目前参与其他临床试验。本研究共纳入9名治疗前NMOSD患者、9名接受糖皮质激素治疗的NMOSD患者和25名健康对照组。

2.2 基本信息收集

记录所有研究参与者的人口统计学特征，包括年龄和性别。对NMOSD患者，测量血清抗水通道蛋白-4（AQP4）抗体水平，并使用扩展残疾状态量表（EDSS）评估神经功能障碍。

2.3 流式细胞术

通过肘前静脉穿刺从所有研究参与者收集外周血样本。使用红细胞裂解液（BD FACS Lysing Solution, 349202）分离PBMCs，并用两个抗体 panel 进行染色。Panel 1：细胞用PerCP/Cyanine5.5抗人CD3（300430, BioLegend）、Brilliant Violet 510?抗人CD4（317444, BioLegend）、APC/Cyanine7抗人CD8（344714, BioLegend）、PE/Cyanine7抗人CD45RA（304126, BioLegend）、PE抗人CCR7（353204, BioLegend）、APC抗人HLA-DR（307610, BioLegend）、Brilliant Violet 421?抗人CD38（303526, BioLegend）染色。Panel 2：细胞用PerCP/Cyanine5.5抗人CD3（300430, BioLegend）、Brilliant Violet 510?抗人CD4（317444, BioLegend）、FITC抗人CXCR3（353704, BioLegend）、APC/Cyanine7抗人CCR6（353432, BioLegend）、PE/Cyanine7抗人CD45RA（304126, BioLegend）、Brilliant Violet 421?抗人CCR7（353208, BioLegend）染色。PBMCs与上述抗体混合物在室温下孵育30分钟。然后用冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞两次。最后，将细胞重悬于500μl PBS中，使用FACS Aria III（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）进行采集。使用FlowJo v10软件分析结果。

2.4 数据分析与统计

使用ANOVA和Bonferroni多重比较校正进行三组间的单变量分析，调整后P值的显著性为0.05。使用线性回归分析年龄和不同组别对T细胞区室的影响。由于多重比较，显著性水平（0.05/3 = 0.017）和置信区间（98.33% CI）进行了调整。对于年龄，显著性水平为0.05，使用95%置信区间。使用SPSS 22.0软件进行统计分析。使用GraphPad Prism 6绘制图表。

2.5 伦理

本研究经天津医科大学总医院伦理委员会批准（IRB2025-YX-113-01）。所有纳入研究的受试者均通过本人或其法定代理人知情同意。

3 结果

3.1 参与者基本信息

本研究包括糖皮质激素治疗前组（PRE）9名研究对象、糖皮质激素治疗组（GC）9名研究对象和对照组25名研究对象。PRE组、GC组和对照组的平均年龄分别为51.56岁、56.22岁和51.00岁。所有研究对象均为女性。17名NMOSD患者抗AQP4抗体阳性，PRE组和GC组的中位EDSS评分均为2。

3.2 糖皮质激素治疗前组、糖皮质激素治疗组和健康对照组淋巴细胞功能亚群差异

ANOVA分析显示，GC组患者的CD8⁺TEM细胞频率显著低于健康对照组（21.71 vs. 35.03，调整P=0.033）。经年龄调整的多变量线性回归分析显示，GC组的CD8⁺TEM细胞少于对照组（β=-14.96，98.33% CI：-26.13至-3.79；P=0.002）。此外，回归分析还表明，TN细胞、CD8⁺TN细胞和CD4⁺TN细胞频率随年龄增长而下降（分别P<0.001、P<0.001、P=0.003）。相反，TEM和CD8⁺TEM细胞频率随年龄增长而增加：每增加一岁，TEM细胞增加0.23（P=0.009），CD8⁺TEM细胞增加0.38（P=0.002）。在CD8⁺TCM和CD4⁺TEMRA细胞亚群中也观察到类似趋势，每增加一岁，CD8⁺TCM细胞增加0.15（P=0.045），CD4⁺TEMRA细胞增加0.14（P=0.047）。

3.3 糖皮质激素治疗前组、糖皮质激素治疗组和健康对照组活化T淋巴细胞亚群差异

ANOVA分析显示，PRE组的HLA-DR⁺CD38⁺CD4⁺T细胞频率高于对照组（2.15 vs. 1.20，调整P=0.014）。PRE组的HLA-DR⁺CD4⁺T细胞频率高于GC组和对照组，分别为3.39 vs. 1.70（调整P=0.016）和3.39 vs. 2.05（调整P=0.022）。经年龄调整的多变量回归分析显示，PRE组的HLA-DR⁺CD38⁺CD4⁺细胞频率高于对照组（β=0.96，98.33% CI：0.16-1.75，P=0.005）。此外，PRE组的HLA-DR⁺CD4⁺T细胞频率高于GC组和对照组（β=1.34，98.33% CI：0.17-2.51，P=0.007；β=1.77，98.33% CI：0.34-3.19，P=0.004）。CD4⁺HLA-DR^-CD38⁺T细胞和CD4⁺CD38⁺T细胞频率随年龄增长显著下降（分别P=0.039和P=0.044）。每增加一岁，CD4⁺HLA-DR^-CD38^-T细胞频率增加0.40（P=0.047）。

3.4 糖皮质激素治疗前组、糖皮质激素治疗组和健康对照组辅助T淋巴细胞亚群差异

ANOVA分析显示，在CD4⁺T细胞中，PRE组的Th1Th17细胞频率高于对照组（15.15 vs. 8.81，调整P=0.003），而Th2细胞频率低于对照组（33.23 vs. 44.62，调整P=0.034）。在CD4⁺TCM细胞中，GC组的频率低于对照组，分别为28.18 vs. 38.05（调整P=0.003）。相反，GC患者组的Th17细胞频率为26.43（5.20），高于对照组的17.97（5.99）（调整P=0.002）。在CD4⁺TEM细胞中，GC组的Th17细胞频率为19.01（8.05），高于对照组的11.28（4.44）（调整P=0.004）。多变量分析结果显示，在CD4⁺T细胞中，PRE患者组的Th1Th17细胞频率高于对照组（β=6.37，98.33% CI：1.96-10.78，P=0.001），PRE组的Th2细胞频率低于对照组（β=-11.41，98.33% CI：-22.26至-0.55，P=0.012）。在CD4⁺TCM细胞中，GC组的Th1细胞频率比对照组低9.57（P=0.001），GC组的Th17细胞频率高于对照组（β=8.22，98.33% CI：2.36-14.09，P=0.001）。在CD4⁺TEM细胞中，GC组的Th17细胞频率高于对照组（β=7.93，98.33% CI：2.33-13.52，P=0.001）。

4 讨论

本研究发现，与健康对照组相比，未经治疗的急性期NMOSD患者表现出更高的CD4⁺Th1Th17细胞频率和更少的CD4⁺Th2细胞。接受糖皮质激素治疗的NMOSD患者CD8⁺TEM细胞频率低于健康对照组。此外，糖皮质激素治疗前急性期NMOSD患者显示更高的CD4⁺HLA-DR⁺CD38⁺T细胞和CD4⁺HLA-DR⁺T细胞频率，而糖皮质激素治疗降低了CD4⁺HLA-DR⁺T细胞频率。

初始T细胞是未接触过抗原的成熟T细胞，具有高增殖潜力。当它们首次遇到抗原时，被激活并分化为效应细胞或记忆细胞。记忆T细胞可分为TCM细胞（中央记忆T细胞）、TEM细胞（效应记忆T细胞）和TEMRA细胞（终末分化效应记忆T细胞），各自表现出不同的归巢和效应功能。当感染或再次暴露于相同抗原时，TCM细胞可迅速增殖并分化为效应T细胞，促进和维持对特定病原体的免疫应答。与TCM细胞相比，TEM细胞增殖能力较弱。它们可在感染后迁移至体内不同组织，并通过接收适当的抗原信号发挥效应功能。TEMRA处于终末分化阶段，具有强效应功能但增殖能力极低。TN细胞随年龄增长逐渐下降，而TCM和TEM细胞增加。记忆T细胞在感染、器官移植排斥和耐受、自身免疫性疾病和肿瘤等过程中发挥关键作用。TEM细胞对病毒病原体具有关键保护作用。

Shi等人的研究表明，与健康对照组相比，NMOSD和MS患者的CD8⁺TN（CD62L^hiCD45RO^-）细胞显著减少，而CD8⁺TE/M（CD62L^loCD45RO⁺）细胞显著增加。接受免疫治疗的NMOSD患者中，CD8⁺TN增加，CD8⁺TE/M减少，这与治疗相关。先前关于MS中CD8⁺TEM细胞的研究结果存在矛盾：Pender等人报道MS患者外周CD8⁺TEM和TEMRA细胞缺陷，提示可能与EBV感染的B细胞和CD8⁺T细胞应答受损有关。本研究发现GC组的CD8⁺TEM细胞频率显著低于对照组，但与PRE组相比无统计学意义。糖皮质激素可能通过抑制TEM细胞的活化和扩增发挥免疫调节作用，从而减轻自身免疫疾病的炎症反应。然而，病毒感染与NMOSD发病之间的相关性尚不明确。目前，大多数相关研究为小样本回顾性研究。本研究显示未经治疗的NMOSD患者TEM细胞呈下降趋势，但这一趋势无统计学意义。这表明NMOSD发病可能与病毒感染存在联系，但需通过更大样本的纵向研究进一步探索。

HLA-DR和CD38是T细胞活化的经典标志物，它们的上调可能与抗原呈递增强、促炎细胞因子释放增加和自身免疫反应加剧相关。在儿童免疫性血小板减少症患者中，CD4⁺HLA-DR⁺T细胞频率显著高于健康对照组。HLA-DR⁺CD38⁺T细胞也在MS中被发现。目前，关于NMOSD患者外周活化T细胞亚群的临床研究较少。本研究发现未经治疗的急性期NMOSD患者表现出更高的CD4⁺HLA-DR⁺CD38⁺和CD4⁺HLA-DR⁺T细胞频率，提示T细胞处于高度活化状态。这一发现支持NMOSD急性期存在广泛T细胞活化的观点，这可能驱动疾病恶化。此外，糖皮质激素治疗显著降低了NMOD患者的CD4⁺HLA-DR⁺T细胞频率。先前研究表明糖皮质激素具有一定的免疫抑制作用。糖皮质激素通过上调促凋亡蛋白Bim和抑制Bcl-2选择性诱导活化T细胞凋亡，这可能导致HLA-DR⁺T细胞减少。糖皮质激素可抑制树突状细胞功能和巨噬细胞的抗炎作用。它们通过抗原呈递和细胞因子间接影响T细胞的分化和活化，并可能减少T细胞活化和HLA-DR表达。

Th1细胞介导对细胞内病原体的免疫应答，也参与某些自身免疫疾病的诱导。它们的主要细胞因子产物是IFNγ和IL-2。IL-2的产生对CD4⁺T细胞记忆至关重要。IL-2在CD8细胞启动阶段刺激CD8⁺T细胞记忆形成中起关键作用。Th2细胞介导对细胞外寄生虫（包括蠕虫）的宿主防御。它们在哮喘和其他过敏性疾病的诱导和持续中发挥重要作用。Th2细胞产生IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-13和IL-25等细胞因子。Th17细胞在清除需要大量炎症反应的特定类型病原体方面具有功能，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及真菌（如白色念珠菌），这些可触发强烈的Th17反应。Th17细胞分泌的主要细胞因子包括IL-17、IL-22和IL-23。它们在自身免疫疾病和一些细菌及真菌感染中发挥重要作用。Th1Th17细胞是通过CXCR3⁺CCR6⁺识别的亚群，共享Th1和Th17细胞的促炎特征。Th1Th17细胞已被发现与多发性硬化等自身免疫疾病的发病相关。

Cao等人的研究发现，急性期NMOSD患者的Th1水平高于缓解期队列和健康对照组。另一项研究仅在MS患者中观察到Th1优势，在NMO患者中未检测到Th1/Th2失衡。本研究观察到糖皮质激素治疗前急性期NMOSD患者的CD4⁺Th2细胞频率低于对照组。GC组CD4⁺TCM细胞中的Th1细胞频率显著低于对照组，但与PRE组相比无差异，提示糖皮质激素治疗可能降低Th1细胞频率。

先前的组织病理学研究表明，NMOSD急性期病变中CD4⁺T细胞浸润显著，缓解期减少，提示辅助T淋巴细胞参与NMOSD发病机制。关于NMO发病机制的研究表明，Th17细胞及其效应分子发挥重要作用。一项荟萃分析报告了八项关于外周血CD4⁺T细胞中Th17细胞频率的研究，显示NMOSD患者的Th17细胞频率高于对照组。此外，NMOSD患者脑脊液和血浆中IL-1β、IL-6、IL-17和IL-21水平升高，血清IL-6、IL-21、IL-22和IL-23水平高于对照组。然而，由于多项研究结果间存在高度异质性，Th17细胞是否为NMOSD疾病活动的可靠生物标志物尚无定论。本研究发现急性期NMOSD患者Th17细胞（包括CD4⁺Th17和Th1Th17亚群）增加。PRE组的Th1Th17细胞频率显著高于对照组。Th17细胞在PRE组高于对照组的趋势，但差异不显著。然而，在GC组中，CD4⁺TCM细胞和CD4⁺TEM细胞中的Th17细胞显著高于对照组，提示短期糖皮质激素治疗未显著降低循环Th17水平。这些发现与先前研究不冲突，并进一步支持Th17细胞，尤其是Th1Th17，在NMOSD发病中的关键作用。

Th17细胞基于其产生IL-17A而被发现和表征。Th17细胞分泌的IL-17A可激活内皮细胞和星形胶质细胞，诱导促炎细胞因子（如IL-6、TNF-α）和趋化因子释放，从而招募髓系细胞（如中性粒细胞）浸润中枢神经系统（CNS）并加剧炎症。IL-17A破坏紧密连接蛋白，增加血脑屏障（BBB）通透性，促进自身抗体（如AQP4-IgG）和CD4⁺淋巴细胞进入CNS。IL-17A可直接激活星形胶质细胞，使其更易受到AQP4-IgG介导的补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性的影响。此外，IL-6是NMOSD中的关键因子，促进Th17分化，而Th17细胞分泌的IL-17和IL-21进一步刺激IL-6产生，放大炎症。总之，Th17细胞 contribute to BBB disruption, CNS inflammatory infiltration, and autoantibody production. 在EAE模型中，共分泌IFN-γ和IL-17的CD4⁺T细胞（Th1Th17细胞）在临床症状出现前浸润大脑，而显著的Th1细胞浸润仅在临床疾病进展后检测到。这表明Th1Th17细胞比Th1细胞表现出更强的促炎活化，可能通过促炎细胞因子和小胶质细胞活化介导CNS炎症。然而，对NMOSD的研究仍然有限。目前大多数研究表明，Th1/Th17平衡在NMOSD中比Th1/Th2平衡发挥更显著的促炎作用，未来研究有必要进一步探讨这一问题。

本研究存在一定局限性。首先，NMOSD是一种罕见的神经系统疾病，发病率低。作为一项单中心研究，纳入病例数有限，未来需在更大样本研究中验证发现。其次，这是一项横断面研究。纵向随访监测NMOSD患者各种T细胞区室的变化对发病机制研究和治疗均具有重要意义。

5 结论

本研究结果进一步强调了Th17细胞，尤其是Th1Th17，在NMOSD发病中的重要性，并提示了潜在治疗靶点。探索针对Th17细胞（如IL-17抑制剂）或T细胞活化（如HLA-DR靶向治疗）的干预策略可能有助于优化NMOSD的免疫调节治疗。此外，糖皮质激素对TEM细胞的调节作用凸显了其在急性期管理中的价值。然而，长期使用可能导致不良反应，需要整合更精确的免疫调节方法以实现长期疾病控制。