基于物理吸附组装的MoS2@Au-LNA纳米复合SERS平台用于microRNA高灵敏检测

本工作创新性地利用物理吸附策略构建了MoS2@Au-LNA纳米复合材料，通过二硫化钼（MoS2

　　

1 引言

二维二硫化钼（MoS₂）作为过渡金属硫化物（TMD）材料，具有1.2-1.9 eV的可调带隙、大比表面积、高化学稳定性和本征生物相容性，是生物传感器应用的理想基质。与石墨烯相比，MoS₂展现出更高的灵敏度，且比铂等昂贵材料更具成本优势。然而其本征催化活性较低，需要通过杂交策略增强灵敏度和信号放大。分子功能化可通过掺杂或非共价杂交实现，从而精确调控其光学和电化学特性。

MoS₂纳米片独特的边缘结构和硫空位缺陷为等离子体金纳米粒子（AuNPs）提供了有利的锚定位点。AuNPs的附着形成密集热点，显著放大局部表面等离子体共振（LSPR）效应和表面增强拉曼散射（SERS）。密度泛函理论（DFT）、Lifshitz-Slyozov-Wagner（LSW）和时域有限差分（FDTD）模拟均已证实这些相互作用的有效性。

microRNA（miRNA）作为复杂疾病中关键的诊断和预后生物标志物，具有重要临床价值。其中miR-210-3p与缺氧肿瘤微环境、血管生成和治疗耐药性显著相关，在乳腺癌、宫颈癌和前列腺癌中表达升高。由于其低丰度特性，传统检测方法面临挑战，需要开发超灵敏生物传感平台。

2 结果与讨论

2.1 Au-LNA SERS探针的合成与表征

采用双功能寡核苷酸策略合成Au-LNA纳米杂化物，包含硫醇修饰的捕获LNA和Cy3标记的检测LNA，与靶标miR-210-3p在可控退火条件下形成双链LNA-miRNA杂交体。硫醇修饰的捕获LNA通过稳健的硫金化学吸附作用实现金纳米粒子（AuNPs）上的定向固定化，Au-S键的形成确保了结合的强度和稳定性。

通过紫外-可见分光光度法系统验证每个制备步骤。LNA-miRNA双链的成功杂交通过吸收光谱的红移和A₂₆₀/A₂₈₀比的显著改变得以证实。双链与AuNPs结合后，局部表面等离子体共振（LSPR）峰发生特征性位移，表明纳米粒子表面修饰成功。具体而言，表面等离子体共振（SPR）峰从裸AuNPs的518 nm红移至520-528 nm，红移范围2-10 nm对应粒子尺寸的增加。较高浓度的miR-210-3p引起更大的SPR峰位移（约10 nm），表明表面覆盖度增加。

动态光散射（DLS）测量显示裸AuNPs的粒径分布为19-21 nm，而复合物的尺寸范围约为30-44 nm，与LNA杂交体浓度增加一致。miR-210-3p浓度与粒径之间呈现强线性相关（R² = 0.9716），证实了缀合效率。Zeta电位从-33.76 mV变为-53.7 mV，负电荷增加增强了颗粒间静电排斥，减少聚集活性，提高了Au-LNA纳米杂化缀合物的稳定性。

2.2 MoS₂@Au-LNA纳米复合材料的制备

采用物理吸附技术构建MoS₂@Au-LNA纳米复合材料，无需化学修饰。通过自发非共价固定化将Au-LNA纳米杂化物组装到MoS₂纳米片的平面表面和活性边缘上，利用MoS₂丰富的硫空位和表面能，形成对SERS增强至关重要的等离子体热点。

制备过程从多层纳米片的制备开始，为功能化提供高表面积基底。预先组装的Au-LNA纳米杂化物通过物理吸附作用固定在MoS₂表面，形成MoS₂@Au-LNA纳米复合材料。MoS₂纳米片的层状结构在不影响其机械完整性的情况下容纳纳米杂化物，促进界面形成，这对增强电磁场效应至关重要。

2.3 MoS₂@Au-LNA纳米复合材料的表征

高分辨率扫描电子显微镜（SEM）显示MoS₂纳米片呈现多层片状结构，横向尺寸140-240 nm，平均纵横比180±60。纳米片表面粗糙有沟壑，多个纳米片相互堆积，为Au-LNA纳米杂化物缀合物的生长提供了大面积平面区域。缺陷和暴露位点作为纳米杂化物探针吸附的潜在域，边缘缺陷增强了吸附亲和力。

引入Au-LNA纳米杂化物并固定到MoS₂纳米片分散体中后，通过非共价相互作用形成纳米复合材料。Au-LNA纳米杂化物均匀分布在平面表面并沿活性片边缘积累，与优先物理吸附一致，证实了纳米杂化物在MoS₂纳米片上的异质生长。Au-LNA纳米杂化物在MoS₂表面的高密度分布导致纳米尺度结的形成，这些结是SERS扩增所必需的活性热点。

紫外-可见光谱分析显示MoS₂在607 nm和670 nm处有特征吸收带，分别对应MoS₂中的B和A激子带。与裸Au结合的MoS₂显示出比未功能化MoS₂薄片更高的吸光度，归因于AuNPs的局部等离子体共振效应。完全功能化的AuNPs引入MoS₂纳米片后，在260-280 nm处出现新峰，表明LNA杂交体成功合成。

光致发光（PL）测量显示裸MoS₂在1.77 eV和1.96 eV有两个主峰，分别对应A激子和B激子。纳米复合材料形成后，PL强度和线宽增加，这些特征可通过MoS₂与Au-LNA纳米复合材料之间的复杂相互作用解释。拉曼光谱显示MoS₂在380 cm^-1和405.14 cm^-1有两个特征峰，分别对应面内（E_2g）和面外（A_1g）振动模式，峰分离25.14 cm^-1证实了多层性质。

X射线光电子能谱（XPS）分析证实了纳米复合材料的化学组成。Mo3d区域在232 eV和236 eV有去卷积峰，对应MoS₂中Mo??的Mo 3d_5/2和Mo 3d_3/2双峰。S 2p拟合区峰归因于S^2-（S 2p_3/2和S 2p_1/2），硫醇化硫（巯基R-SH）和氧化硫物种S⁴⁺。Au 4f区域在83.5 eV和87.4 eV有两个 distinct峰，归因于Au 4f_7/2和Au 4f_5/2轨道。N 1s区域显示宽而复杂的发射谱，归因于DNA和RNA等多种生物分子来源的氮存在。

2.4 MoS₂@Au-LNA纳米复合材料的SERS性能评估

通过浓度依赖性分析验证纳米复合材料检测低浓度miRNA的SERS性能。对照光谱记录了Cy3修饰的检测LNA（det-LNA-Cy3）、Au-LNA纳米杂化物和MoS₂@Au-Cy3。MoS₂@Au-Cy3的光谱用作参考，与MoS₂@Au-LNA纳米复合材料的SERS强度进行比较。

在约1389 cm^-1和1585 cm^-1的特征峰处绘制SERS信号图，这些峰随miRNA浓度增加显示最明显的强度增加。基于纳米复合材料形成后的最终miR-210-3p浓度进行SERS测量和分析，工作浓度对应15.525 nM、31.25 nM、46.875 nM、62.5 nM和93.75 nM最终miRNA浓度。最低浓度显示最弱的拉曼强度，而最高浓度表明最显著的信号变化，突出了平台对SERS活性的敏感性。

在约1389 cm^-1和1585 cm^-1两个稳定特征峰处绘制平均拉曼强度与浓度的线性回归校准曲线，线性相关（R²）分别为0.848和0.9191。这些回归证实了良好的线性，特别是约1585 cm^-1峰，强调其稳定性和可靠性。根据IUPAC定义计算检测限（LOD），LOD = 3σ/s，其中σ和s分别是参考/空白（n=3）的标准偏差和校准曲线的斜率。两个峰的LOD分别确定为30 nM（约1389 cm^-1）和11 nM（约1585 cm^-1）。约1585 cm^-1峰表现出最可靠的增强和卓越的灵敏度，归因于等离子体放大下的芳香环拉伸。

计算纳米复合材料在约1585 cm^-1峰的增强因子（EF），基于目标miRNA的最佳浓度15.5 nM，获得中等EF值10.22。研究发现表明成功制备了具有最佳SERS性能的稳健MoS₂@Au-LNA纳米复合材料。与其他报道方法相比，该平台显示出相当的灵敏度，具有中等至高灵敏度、制造简单性、信号清晰性和适用性。

3 结论

实验研究通过非共价物理吸附策略制备MoS₂@Au-LNA纳米复合材料，紧密验证了理论预测。高分辨率SEM图像揭示Au-LNA纳米杂化物在MoS₂纳米片平面表面和缺陷边缘的异质簇集，为实际物理吸附提供了令人信服的证据。利用物理吸附相互作用，无需化学修饰，Au-LNA纳米杂化物在MoS₂纳米片上的稳定固定化展示了构建稳健灵敏SERS生物传感器的实用策略。

MoS₂@Au-LNA纳米复合材料的两步制备显示拉曼信号显著改善，验证了其对Cy3标记的miR-210-3p灵敏检测的效用。在特征Cy3峰（1389-1394 cm^-1和1582-1590 cm^-1）观察到的复合材料稳定性和拉曼富集信号证实了MoS₂和AuNPs的协同等离子体耦合。这种协同作用增强了源自Au-LNA拉曼探针的局部表面等离子体共振（LSPR）效应和由MoS₂与Au-LNA纳米探针界面引起的电磁场限制，这些是SERS现象的关键机制。

该策略为设计能够检测miRNA的光学可靠混合纳米结构提供了简化而强大的途径，桥接了理论和实验验证与应用，并具有与其他平台相当的检测限。虽然本研究成功建立了物理吸附MoS₂@Au-LNA纳米复合材料SERS平台用于miRNA检测的概念验证，但未来研究将探索调整缺陷密度、混合结构控制和替代拉曼报告基因，以最大化这种有前途的SERS生物传感平台的全部潜力。

4 实验部分

使用Nanocomposix的柠檬酸盐稳定20 nm金纳米粒子（0.05 mg mL^-1，6.8E+11 particles mL^-1）和Graphene supermarket的MoS₂ flakes（18 mg L^-1，99%纯原始薄片）。锁核酸（LNA）探针和定制miR-210-3p寡核苷酸从Integrated DNA Technology（IDT）购买。

使用WiTec Alpha300R共聚焦拉曼显微镜获得拉曼光谱，激发波长532 nm。紫外-可见吸收光谱使用Agilent Cary 7000 UV-vis-NIR测量。颗粒尺寸和稳定性使用Malvern动态光散射（DLS）Zetasizer Ultra测量。形貌和拓扑特征使用Zeiss Auriga场发射扫描电子显微镜（FIB/FESEM）获得。XPS分析使用Thermo Fisher ESCALAB 250 Xi进行。

Au-LNA纳米杂化物缀合物的制备涉及两个部分LNA寡核苷酸与目标miRNA的杂交，随后通过硫醇介导的表面化学与AuNPs生物缀合。MoS₂@Au-LNA纳米复合材料的制备涉及将MoS₂薄片与Au功能化的miR-210-3p LNA杂化物（Au-LNA纳米杂化物）结合，轻柔涡旋并在室温下孵育过夜。通过SEM、紫外-可见光谱、拉曼光谱和XPS映射对形成的纳米复合材料进行表征。