芦荟凝胶乙醇提取物对医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Ha-MRSA）抗菌活性的评估及其机制探讨

本研究系统评估了芦荟（Aloe vera）凝胶提取物对医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Ha-MRSA）的抗菌活性，发现乙醇提取物在肉汤稀释法中表现出显著抑制效果（最低抑菌浓度MIC=0.2 mg/L），而DMSO提取物无效。研究为开发植物源抗菌剂提供了关键数据，对解决多重耐药菌（AMR）引发的公共卫生危机具有重要参考价值。

　　

摘要

芦荟作为一种药用植物，具有悠久的应用历史和广泛的治疗用途。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）则是一种对常见抗生素（如青霉素）具有耐药性的细菌。医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Ha-MRSA）特指在医院环境中获得的MRSA感染，通常发生在入院48小时或更久之后，或发生在近期有住院史的个体中。本研究旨在探讨芦荟凝胶提取物对Ha-MRSA的有效性。

1. 引言

芦荟（Aloe barbadensis）因其叶片和其他部位具有多样的美容和药用功效而几个世纪以来一直受到科学界的关注。研究表明，无论是局部外用还是作为果汁或提取物食用，芦荟及其衍生物都对人类健康产生积极影响。诸多科学研究强调了其广泛的生物活性，包括抗病毒、抗菌、抗肿瘤和抗真菌特性。在印度、南美部分地区和非洲的传统医学中，使用芦荟治疗各种伤口和皮肤疾病，这表明其凝胶提取物中的植物化学成分有望成为对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的潜在解毒剂。抗生素的过度使用增加了微生物抗菌素耐药性（AMR）的风险，这是一个重大的全球公共卫生问题。此外，由于细菌耐药性，各种抗生素已被证明无效。多项研究调查了芦荟凝胶提取物抑制金黄色葡萄球菌生长的潜力。MRSA是全球最具挑战性的抗生素耐药性细菌之一，可引起严重感染，如骨骼、关节、中枢神经系统感染和严重的呼吸道感染。加纳一家医院对MRSA分离株进行的分子特征研究显示，医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Ha-MRSA）在测试分离株中的流行率为47%，并强调了对多种抗生素的多重耐药性。Ha-MRSA是医疗保健相关感染的重要病因，常导致血流感染、肺炎和手术部位感染。由于其多重耐药性，治疗困难，与较高的发病率和死亡率相关。抗菌药物管理和耐药性对个人、医疗系统和政府的经济影响不容小觑。在加纳，抗菌素耐药性是一个严重的公共卫生问题，因为治疗由耐药菌株引起的感染很复杂，这些菌株可能迅速在人群中传播至地方病和流行病水平。评估传统医学中植物药物的功效至关重要，因为这些治疗方法副作用少、成本低且易于获得。多重耐药病原菌的生长和传播推动了对新抗菌药物来源的研究，例如植物代谢物。多种植物已通过药理学测试，从而开发出新型抗生素。植物具有源自其独特生物活性成分的有益多效作用。芦荟是一种具有广泛药用效益的前景广阔的植物。尽管芦荟长期以来以其抗菌特性闻名，但关于其对已对多种抗生素产生更强耐药性的Ha-MRSA敏感性的信息并不易得。本研究结果可提供初步数据，指导和探索发现可能有效治疗Ha-MRSA感染的生物活性化合物。本研究旨在确定芦荟凝胶提取物对Ha-MRSA菌株的抗菌活性。

2. 材料与方法

2.1. 芦荟样品的采集与制备

芦荟植物采购自加纳中部地区Kasoa（GPS纬度5°33′27″，经度0°24′51″）的一个专业芦荟农场。随后，将植物送交Entrance University of Health Sciences生药学系进行鉴定。

2.2. 样品制备

将完全成熟且健康的芦荟植物的新鲜叶片在自来水下彻底清洗5分钟。随后，用无菌蒸馏水清洗叶片。接着，用无菌刀纵向解剖叶片，确保去除无色芦荟凝胶（薄壁组织）并排除纤维。提取的凝胶然后在60°C的烘箱中风干72小时。凝胶完全干燥后，用研钵和杵研磨成细粉。

2.3. 二甲基亚砜（DMSO）提取

将20克芦荟粉末浸泡在200毫升DMSO中，在室温下放置4天，以促进芦荟凝胶中活性成分的提取。二甲基亚砜用于芦荟提取是因为其能够溶解多种化学物质，包括极性和非极性分子，从而有助于从芦荟中提取各种生物活性成分。此外，DMSO被认为对生物系统相对安全，并与多种测定技术兼容，使其成为研究应用中灵活的溶剂。提取后，使用Whatman 1号滤纸进行抽滤，所得滤液使用旋转蒸发仪蒸发至干（转速从120 RPM开始，在2小时内增至150 RPM）。滤液进一步使用冷冻干燥机进行冻干，以确保去除所有水分。上清液或剩余液体随后收集并在4°C的冰箱中储存。DMSO和无菌蒸馏水用作阴性对照。在用于抗菌敏感性测试之前，将一批提取物溶解在无菌蒸馏水中。此步骤确保了提取物适用于预期的测试目的。

2.4. 乙醇提取

将20克芦荟粉末浸泡在200毫升乙醇中，在室温下放置4天。乙醇因其能够溶解多种化学物质（包括极性和非极性成分）而广泛用于植物提取。提取后，使用Whatman 1号滤纸进行抽滤，所得滤液使用旋转蒸发仪蒸发至干。滤液进一步进行冻干以确保去除所有水分。上清液或剩余液体随后收集并在4°C的冰箱中储存。在用于抗菌敏感性测试之前，将一批提取物溶解在无菌水中。此步骤确保了提取物适用于预期的测试目的。

2.5. 琼脂平板的制备

根据制造商的说明制备Mueller-Hinton琼脂（Oxoid, CM0337）。简要步骤如下：在干净的培养基瓶中将19克脱水Mueller-Hinton琼脂粉末称重并溶解于500毫升蒸馏水中。通过旋摇彻底混合，然后在热板上加热直至琼脂完全溶解。通过在121°C下高压灭菌15分钟对培养基进行灭菌。高压灭菌后，将琼脂冷却至约60°C，然后在层流洁净罩中无菌倒入无菌培养皿（每板20毫升）。平板在室温下凝固，倒置并在37°C孵育24小时后检查无菌性后方可使用。

2.6. 接种物的制备

通过将单个菌落传代培养到营养琼脂上，并在37°C孵育24小时，获得Ha-MSRA的新鲜纯培养物。随后，将大约3-5个Ha-MSRA的单个菌落转移到含有5毫升无菌Mueller-Hinton肉汤培养基（Oxoid, CM0337B）的试管中，该培养基根据制造商的说明制备。进行彻底混合以分散细菌。然后将接种的肉汤培养物涡旋混合，并在37°C下孵育24小时以促进细菌生长。然后使用比浊仪（BD PheonixSpec, 440910, United States）评估并调整光密度浊度至0.5 McFarland标准（约1–2 × 10⁸ CFU/mL），以确保接种物密度一致。

3. 敏感性测试

3.1. 琼脂平板接种

使用金黄色葡萄球菌亚种 aureus ATCC 25923菌株作为对芦荟凝胶提取物敏感性测试的对照菌株。将无菌拭子浸入接种物容器中，确保拭子不过度湿润。然后通过在整个琼脂表面划线三次来接种Mueller-Hinton琼脂平板的干燥表面。每次划线后将平板旋转约60度以确保接种物均匀分布。将拭子丢弃到适当的容器后，让接种的琼脂平板在室温下风干5分钟，然后进行下一阶段。

3.2. 植物提取物打孔

使用直径为6毫米的打孔器在已接种的琼脂平板上打孔。对于每种Ha-MRSA菌株，总共在琼脂表面打七个孔。其中五个孔分别含有20%、40%、60%、80%和100%的不同浓度的植物提取物。一个孔含有阳性对照（苯唑西林）浓度，剩余一个孔含有阴性对照（无菌蒸馏水）。确保孔与孔之间的距离不小于24毫米（中心到中心测量）。随后，对培养皿进行适当标记和标注。接着，将4毫升每种样品移液到各自的孔中。将平板放入 incubator 中，在37°C下孵育24小时。之后，从 incubator 中取出平板，并测量抑菌圈。

3.3. 琼脂平板孵育

3.3.1. 抑菌圈测量

孵育期结束后，使用直尺目视评估抑菌圈，测量至最接近的毫米（mm）。测量在平板的下表面进行， specifically measuring the diameter of the zones surrounding the plant extracts and the positive control, respectively.

3.3.2. 肉汤培养

用接种环接种菌落后，将生长物转移到按制造商说明制备的Mueller-Hinton肉汤中。将肉汤在37°C孵育直至其浊度达到0.5 McFarland标准。将制备好的接种物在肉汤中稀释，以达到5 × 10⁵ CFU/mL的最终微生物浓度。稀释过程确保获得了所需密度的微生物以进行进一步实验。从储备提取物溶液（100%；100 mg/L）中取1毫升与1毫升0.5 McFarland标准混合，得到0.1 mg/L的浓度，用于第一系列稀释和测量。随后，还分别进行了20%、40%、60%、70%、80%和100%的稀释。

4. 结果

4.1. 芦荟凝胶提取物对Ha-MRSA的敏感性测试

表1和表2显示了DMSO中芦荟凝胶提取物的肉汤稀释试验结果，而表3和表4显示了乙醇介质提取的结果。芦荟凝胶提取物的最低抑菌浓度（MIC）以毫克每升表示，这是规定的标准报告系统。在肉汤稀释测试方法中，DMSO中的芦荟凝胶提取物对Ha-MRSA耐药（表1和表2）。乙醇芦荟凝胶提取物在0.02、0.04、0.05、0.06和0.07 mg/L的MIC下抑制Ha-MRSA（表3），直到在0.2 mg/L（从0.08、0.09、0.1和0.12 mg/mL开始）实现完全抑制（表4）。表5和表6显示了DMSO和乙醇中芦荟凝胶提取物在琼脂扩散法中的抑菌圈结果。在浓度高达100%时，DMSO和乙醇介质中的芦荟凝胶提取物均对Ha-MRSA菌株耐药。然而，使用的标准抗生素药物在肉汤和琼脂介质中对Ha-MRSA均耐药。

4.2. 芦荟凝胶提取物抗菌活性评估

针对芦荟凝胶提取物浓度测定了各种MIC。它还表明，微生物对提取物的敏感性在中间MIC和最终MIC的菌株之间存在显著差异。这些差异不太可能是随机偶然造成的，因为F检验和p值0.01相对于标准p值0.05表明具有统计学显著性。这表明芦荟凝胶提取物对细菌菌株有效。

4.3. 统计分析

本研究获得的数据使用单向方差分析（one-way ANOVA）进行分析。显著性差异确定为95%（p < 0.05），p < 0.05具有统计学显著性。获得的p值为0.016，表明中间和最终MIC之间芦荟凝胶提取物对Ha-MRSA菌株的影响（通过MIC测量）存在统计学显著性差异。

5. 讨论

Ha-MRSA是一种发生在医院和疗养院等医疗机构的MRSA感染。它通常与侵入性手术、长期住院和免疫功能低下有关。Ha-MRSA感染可导致严重后果，包括血流感染、肺炎和败血症。本研究旨在探讨芦荟凝胶提取物对Ha-MRSA（更强毒力菌株）的有效性。Ha-MRSA菌株对芦荟凝胶乙醇提取物敏感，在肉汤稀释法中MIC为0.2 mg/L（完全抑制）（表4），从0.02 mg/L开始（表3）。芦荟凝胶提取物在较低浓度下抑制Ha-MRSA；这使其比研究结果更有效。在一项关于“抗菌组合对抗MRSA的协同潜力”的研究中，Ha-MRSA（临床菌株）对苯唑西林在MIC分别为4和128 mg/L时表现出耐药性。同样，一项关于“新型β-内酰胺组合对抗MRSA的协同杀菌活性”的研究工作显示，阿莫西林的MIC范围从32 mg/L >> 1024 mg/L，头孢地尼的MIC范围从1 mg/L >> 256 mg/L。在当前研究中，标准抗生素苯唑西林在4 mg/L浓度下未能显示出对Ha-MRSA菌株的活性。然而，当使用琼脂扩散法进行敏感性测试时，Ha-MRSA菌株对芦荟凝胶提取物耐药。据解释，这可能是由于琼脂扩散测定法可能受到提取物成分在水性介质中扩散差异的影响。

Ha-MRSA菌株对DMSO芦荟凝胶提取物耐药（表1和表2）。这可以与进行的研究相比较。他们发现三种选定植物（金盏花、贯叶连翘和光果甘草）的DMSO提取物的MIC低于标准氨苄青霉素，与预期相反。他们将这种现象归因于所涉及植物的生理类型、所使用的植物部位以及提取物的数量。他们还发现植物植物化学物质与DMSO之间的相互作用是原因。据解释，这可能是由于芦荟凝胶植物化学成分与DMSO之间的相互作用。芦荟凝胶提取物含有多种生物活性化合物，包括多糖、酶和其他物质。这些成分可以以拮抗方式与DMSO中的其他分子相互作用，可能影响其活性。这导致了分子间的拮抗效应；因此，无论是芦荟凝胶植物化学成分还是DMSO都没有被释放出来抑制Ha-MRSA菌株。

6. 结论

从研究中得出结论，Ha-MRSA菌株在中间和最终MIC时对乙醇芦荟凝胶提取物敏感，使用肉汤稀释法抑制了Ha-MRSA菌株的生长。然而，Ha-MRSA菌株对DMSO介质中的芦荟凝胶提取物耐药。需要进一步的研究来确定负责该活性的生物活性剂。

命名法

MIC：最低抑菌浓度

Ha-MRSA：医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

部分敏感：意味着Ha-MRSA菌株既不完全耐药也不完全敏感

中间MIC：指介于敏感和耐药之间的MIC

披露

所有作者均已阅读并批准最终稿件出版。

利益冲突

作者声明无利益冲突。

作者贡献

J.G.和J.K.构思了研究，并参与了方法设计、样品收集、实验室分析、监督、数据分析、撰写初稿、审阅和编辑终稿。E.N.Y.N.和J.A.参与了方法设计、数据整理和撰写、审阅和编辑终稿。E.E.A-D.和S.H.为终稿的审阅和编辑做出了贡献。F.O.参与了方法设计、实验室分析和终稿编辑。

资助

本手稿未收到任何资助。

致谢

作者感谢Entrance University of Health Sciences的Mr. Sereboo, Richard Ofori, Dr. Gideon Akolgu和Reginald Asmah的指导。我们感谢Aloe Farms的Grace Kontoh提供芦荟。我们感谢Mrs. Esther Amoako Gyamerah的关心和支持。非常感谢Mr. Christian Bonsu提供实验室支持。