Adaptaquin通过破坏铁与胆固醇代谢选择性靶向胶质瘤干细胞

本文推荐Adaptaquin（AQ）作为靶向胶质瘤干细胞（GSCs）的新型治疗策略。研究揭示AQ选择性诱导GSCs死亡，同时保护神经元及成熟胶质细胞。其机制涉及铁代谢基因（如TFRC、FTH1、FTL）上调和胆固醇合成基因（如HMGCS1、SQLE）下调，且与铁螯合剂联用可协同破坏胆固醇稳态，导致线粒体功能障碍和活性氧（ROS）积累。该发现为胶质母细胞瘤（GBM）治疗提供了代谢干预新视角。

　　

引言

胶质母细胞瘤（GBM）作为最常见且高度致死性的脑肿瘤，占所有原发性脑和恶性中枢神经系统（CNS）肿瘤的50%，年年龄调整发病率为每10万人3.19至4.17例。GBM预后极差，平均生存期仅为10至20个月，仅有5%的患者能够达到5年的长期生存。标准疗法包括手术切除、放疗和替莫唑胺（TMZ）化疗，然而这些治疗在延长患者生存期的同时，85%的长期存活者会遭受神经系统后遗症，因为颅脑放疗或TMZ同样具有神经退行性副作用。因此，寻找既能靶向胶质瘤干细胞（GSCs）又具有神经保护作用的新型药物类别显得尤为重要。

胶质母细胞瘤具有高代谢活性、高增殖和高迁移特性。患者肿瘤中表现出胆固醇摄取和铁代谢水平升高，这与不良预后相关。事实上，这种代谢活性已成为靶向这些通路的治疗策略的焦点。然而，铁运输在胶质瘤进展中的确切作用尚未完全阐明。铁对于肿瘤细胞增殖至关重要，但其失调可能导致毒性效应，例如通过Fenton反应促进氧化应激，并通过铁死亡（ferroptosis）诱导调节性细胞死亡。

尽管GBM中HIF1α水平升高与增殖、生存、侵袭和化疗耐药性相关，但抑制脯氨酰羟化酶（PHDs）以阻止HIF1α降解却能够诱导GBM细胞死亡。Adaptaquin（AQ）作为一种羟基喹啉类PHDs抑制剂，已通过抑制促铁死亡基因表达、保护神经元免受谷氨酸诱导的死亡以及恢复神经元线粒体功能而显示出神经保护作用。由于AQ能够穿透血脑屏障，它已被用于神经退行性疾病的临床前神经保护研究。例如，在小鼠脑出血模型和帕金森病模型中，AQ通过抑制促铁死亡基因来防止神经元损失。

我们假设AQ可能代表了一类新型小分子，能够在损害GSCs活力的同时保护神经元。本研究旨在展示AQ如何选择性诱导GSCs和增殖性细胞死亡，同时保护成熟神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。

材料与方法

研究使用了患者来源的GSCs和弥漫内生性桥脑胶质瘤（DIPGs），这些细胞系来自Glioma Cellular Genetics Resource，并在NHS Health Research Authority的伦理批准下生成。所有GSCs均为IDH野生型胶质母细胞瘤来源细胞系。细胞在层粘连蛋白包被的培养板上以单细胞形式铺板，并在GSC培养基中维持培养。培养基成分包括DMEM/F12、0.5× B27、0.5× N2、1× MEM NEAA、0.012% BSA、0.1 mM 2-巯基乙醇、1.45 g·L^?1 D-葡萄糖以及青霉素-链霉素，并添加了10 ng·mL^?1 EGF、10 ng·mL^?1 bFGF和1 μg·mL^?1层粘连蛋白。细胞在37°C、5% CO₂、20% O₂的湿润培养箱中培养，每2-3天更换一次培养基。细胞使用Accutase解离后进行传代。所有实验均使用无支原体污染的细胞进行，所有细胞系均在过去3年内通过单细胞10×多组学技术进行了认证。

低氧条件通过将培养箱中的氧气浓度降低至1%或5%来实现。培养箱设计有内部隔间或次级门，以在开门时最小化氧气流入，确保稳定的低氧条件。

原代小鼠神经干细胞（NSCs）从C57BL/6小鼠（JAX, 000664）的P0-P3新生鼠脑中分离。小鼠的饲养、处理和安乐死均遵循剑桥大学生物医学服务指南和英国内政部规定，批准的动物项目许可证号为PP4690795。脑组织解剖后分离室下区（SVZ），并在Hibernate-A中处理。SVZ组织在37°C下用胰蛋白酶消化5分钟，随后用P1000移液器轻轻吹打1-2分钟，离心后重悬于GSC培养基中。细胞裂解物以每脑3孔的比例铺板于层粘连蛋白包被的24孔板中，并在37°C、5% CO₂、20% O₂的湿润培养箱中培养。第二天，将3孔中的培养基再次吹打后铺入新的3孔中，并向原孔中添加新鲜培养基。每两天更换一次GSC培养基，直到细胞达到50-70%汇合度。细胞随后用Accutase解离并铺入层粘连蛋白包被的T25培养瓶中进行扩增。神经干细胞的纯度通过Pax6的免疫细胞化学检测评估，细胞在含有10% DMSO的GSC培养基中于-80°C保存。神经干细胞在层粘连蛋白包被的培养板上用GSC培养基培养，每2-3天更换一次培养基。实验在传代6次之前进行。

原代大鼠少突胶质细胞前体细胞（OPCs）、少突胶质细胞（OLs）和星形胶质细胞的分离从Wistar大鼠（RGD_13508588）的P4-P7新生鼠脑中完成。大脑在Hibernate-A中解剖，去除嗅球和脑膜后，用无菌手术刀切成小块，并在含有34 U·mL^?1木瓜蛋白酶溶液和20 μg·mL^?1 DNAse1的Hibernate-A中于37°C消化40分钟。脑裂解物离心后重悬于中和溶液中，并通过火焰抛光的巴斯德移液器吹打获得单细胞悬液。细胞裂解物通过70 μm细胞筛网过滤后加入22.5% Percoll溶液中，最终体积为50 mL。离心后去除上清，细胞用冰预冷的HBSS洗涤，随后用红细胞裂解缓冲液处理1分钟。细胞再次用HBSS洗涤后离心，从细胞沉淀中分离星形胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞。

星形胶质细胞的分离通过抗GLAST（ASCA-1）微珠进行。细胞在冰预冷的MWBi培养基中与微珠孵育10分钟，随后添加MWBi培养基并离心。细胞沉淀重悬于MWBi培养基中，并与抗生物素微珠孵育15分钟。之后，细胞悬液加载到MACS LS柱中，通过MACS Multistrand按照制造商说明分离GLAST阳性细胞，并重悬于星形胶质细胞培养基中。星形胶质细胞铺板于多聚-L-赖氨酸包被的培养板上，并在37°C、5% CO₂、5% O₂的条件下培养4-7天。每次分离的细胞纯度通过DAPI和GFAP的免疫细胞化学检测评估。

少突胶质细胞前体细胞（OPCs）的分离和少突胶质细胞的成熟通过抗-A2B5抗体进行。细胞在冰预冷的MWBi培养基中与抗体孵育30分钟，随后添加MWBi培养基并离心。细胞沉淀重悬于MWBi培养基中，并与抗小鼠IgM微珠孵育15分钟。之后，细胞悬液加载到MACS LS柱中，通过MACS Multistrand分离A2B5阳性细胞，并重悬于OPC培养基中。OPCs铺板于多聚-D-赖氨酸包被的培养板上，并在37°C、5% CO₂、5% O₂的条件下用OPC培养基培养。细胞纯度通过DAPI和Olig2的免疫细胞化学检测评估。少突胶质细胞分化通过将OPC培养基更换为OL培养基（基础培养基添加40 ng·mL^?1 T3）并进行7天培养后完成。

原代大鼠海马神经元的分离从Wistar大鼠（RGD_13508588）的P0-P2新生鼠脑中完成。海马组织在Hibernate-A中解剖，切成小块后在含有34 U·mL^?1木瓜蛋白酶溶液和20 μg·mL^?1 DNAse1的Hibernate-A中于37°C消化20分钟。组织裂解物离心后重悬于中和溶液中，并通过逐渐减小的火焰抛光巴斯德移液器吹打获得单细胞悬液。细胞悬液通过40 μm细胞筛网过滤后铺板于24孔板中3分钟。之后，细胞悬液从板上移除，少量用于血细胞计数仪计数。细胞以每平方厘米100,000个细胞的密度铺板于多聚-D-赖氨酸包被的培养板上，并在铺板培养基中于37°C、5% CO₂、20% O₂的条件下培养。第二天，培养基更换为神经元培养基，并添加10 μM 5-氟-2'-脱氧尿苷（FDU）培养2天。之后2天更换为无FDU的神经元培养基，随后再更换为含FDU的培养基2天。最后，细胞在无FDU的神经元培养基中维持至少10天后进行药物处理。细胞纯度通过双目显微镜下的形态学评估。

人诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元通过iPSC-NG2细胞系生成。细胞用Accutase解离为单细胞后，以每平方厘米25,000个细胞的密度铺板于预涂玻连蛋白的6孔板中，并在STEMFLEX培养基中添加10 μM ROCK抑制剂Y-27632培养。在第1天和第2天，培养基更换为D1-D2培养基；第3天更换为D3培养基；第4天，细胞用Accutase解离后以每平方厘米60,000个细胞的密度铺板于多聚-D-赖氨酸包被的培养板上，并在D3培养基中添加1 μg·mL^?1多西环素、10 ng·mL^?1 NT3、10 ng·mL^?1 BDNF和10 μM ROCK抑制剂Y-27632。第5天和第6天更换培养基时不添加ROCK抑制剂。第8天，一半培养基更换为添加10 ng·mL^?1 NT3和10 ng·mL^?1 BDNF的D3培养基。实验在第10天进行。定期进行支原体检测，所有实验均使用无支原体污染的细胞。

人胚胎干细胞（hESC）来源的脑类器官培养使用H9 hESC（WiCell, WA09）在vitronectin包被的培养板上用TeSR培养基培养。脑类器官使用STEMdiff Cerebral Organoid Kit按照制造商说明生成。简要来说，在第0天，hESC集落用Accutase解离为单细胞悬液，以每孔9000个细胞的密度接种于96孔圆底超低吸附板中，每孔100 μL接种培养基。在第2天和第4天，每孔添加100 μL类器官形成培养基。第5天，类器官直径应达到400-600 μm。选择最圆润且边缘光滑的类器官转移到6孔超低吸附板中，内含诱导培养基，并在37°C、5% CO₂的湿润培养箱中培养48小时。第7天，每个类器官用Matrigel包裹30分钟，并置于扩增培养基中培养3天。第10天，培养基更换为成熟培养基，并在37°C、5% CO₂的湿润培养箱中的轨道摇床上维持培养。培养基每周更换两次成熟培养基，并继续培养20周。经过2天每天7 μM Adaptaquin处理后，类器官用4%多聚甲醛固定1小时，PBS洗涤后加入30% PBS-蔗糖中于4°C过夜。类器官随后用OCT包埋，-80°C保存后进行16 μm厚度的冰冻切片。在免疫组织化学（IHC）之前，类器官冰冻切片用PBS洗涤，并通过在80°C的柠檬酸盐缓冲液pH 6中孵育10分钟进行抗原修复。定期进行支原体检测，所有实验均使用无支原体污染的细胞。

药物处理中使用的化合物包括：Adaptaquin（AQ）（ApexBio, #C4377）用DMSO重构；deferoxamine（DFO）（Sigma, #D9533）用水重构；十二水合硫酸铁铵（Ferric iron）（Sigma, #F3629）用GSC培养基重构；七水合硫酸亚铁（Ferrous iron）（Sigma, #F8633）用GSC培养基重构；胆固醇（Sigma, #C2045）用100%乙醇重构； Hemin（Sigma, #H9039）用40 mM NaOH重构； Zn(II) Mesoporphyrin IX（ZnMP）（Insight Biotechnology, #sc-396862）用DMSO重构； Mn(III) Protoporphyrin IX chloride（MnPP）（Santa Cruz Biotechnology, #sc-396877A）用DMSO重构；以及Gw3965（Sigma, #G6295）用DMSO重构。DMSO、水、40 mM NaOH或100%乙醇用作载体处理。

细胞毒性通过MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）测定法测量。细胞在96孔板中培养后，使用MTT测定试剂盒（Abcam, #ab211091）按照制造商说明测量细胞活力。细胞毒性通过微孔板吸光度读数器（SPECTROstar Nano）测量。细胞密度测量在Incucyte S3 Live-cell Analysis System中进行，并在37°C、5% CO₂的湿润培养箱中完成。Incucyte图像使用incucyte s3 Software v. 2018A分析。

铁和胆固醇含量测量通过收集细胞后用RIPA缓冲液裂解完成。蛋白质浓度使用Pierce BCA Protein Assay kit（Thermo scientific, #23227）测量，吸光度在微孔板读数器中读取。剩余细胞裂解物用于测量胆固醇含量或铁含量。铁浓度使用Iron Assay kit（Sigma, #MAK025）测量，通过比色法在微孔板吸光度读数器中检测总铁。胆固醇浓度使用Amplex Red Cholesterol Assay kit（Thermofisher, #A12216）测量，通过荧光法在微孔板荧光读数器（SpectraMax Spectrofluorometers）中检测总胆固醇。每个条件的胆固醇或铁含量定义为每毫克蛋白质的含量。

免疫荧光通过用4%多聚甲醛固定细胞15分钟，PBS洗涤三次后完成。固定细胞在封闭缓冲液（3%牛胎 albumin、0.3% Triton X100 in PBS）中孵育1小时。之后，细胞与一抗在封闭缓冲液中4°C孵育过夜。一抗包括：anti-Olig2（RND System, #BAF2418）1:200、anti-Pax6（RND System, #AF8150）、anti-TFRC（Abcam, #ab84036）1:200、anti-MBP（Biorad, #MCA409S）1:100、anti-GFAP（Dako, #Z0334）1:400、anti-NFM（Millipore, #AB1987）1:200、anti-TUJ1（Abcam, #ab41489）1:200、anti-mitochondria（Abcam, #ab92824）1:200。第二天，细胞用封闭缓冲液洗涤三次后，与Alexa Fluor二抗（Thermofisher）1:500在封闭缓冲液中室温孵育1小时。孵育后，细胞用封闭缓冲液洗涤三次，与Hoechst（Life Technologies, #H3570）1:2000在PBS中孵育15分钟，最后用PBS洗涤一次。荧光图像使用Operetta CLS High-Content Analysis System拍摄，并在harmony v. 4.9和Omero中分析。

活性氧（ROS）、Calcein-AM、ZnMP成像通过CellROX Green Reagent（Thermofisher, #C10444）测量。细胞用5 μM CellROX试剂在GSC培养基中37°C孵育30分钟，随后用PBS洗涤两次后直接使用EVOS M5000 Imaging System成像。图像使用fiji分析，CellROX信号使用cell profiler v.4.2定量。活细胞成像使用LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity kit（Sigma, #L3224）进行。活细胞用Calcein-AM标记，Calcein-AM是一种细胞渗透性染料，被细胞内酯酶转化为绿色荧光形式，从而可视化活细胞。细胞用0.5 μM Calcein-AM孵育20分钟后，用PBS洗涤两次后直接成像。Zn(II) Mesoporphyrin IX（ZnMP）的摄取通过用1、5或10 μM ZnMP处理细胞30分钟后，固定细胞并用DAPI孵育15分钟，图像在DMi8 Inverted confocal microscope中获取，并使用fiji分析，ZnMP信号使用cell profiler v.4.2定量。

Western blot通过用冰预冷PBS洗涤细胞后，用2× SDS样品缓冲液（添加denarase）裂解细胞完成。细胞用细胞刮刀收集后立即-80°C保存。解冻样品在95°C孵育5分钟后离心，10 μL上清液加载到4-12% Bis Tris NuPAGE凝胶上，按照制造商说明进行蛋白质迁移，迁移条件为90伏特15分钟随后120伏特。迁移后，蛋白质转移到PVDF膜上，使用冰预冷的Bolt Transfer Buffer在15伏特下转移1小时。膜在封闭缓冲液（3%脱脂牛奶 in TBSt）中封闭1小时，随后与一抗在封闭缓冲液中4°C孵育过夜。一抗包括：anti-TFRC（Abcam, #ab84036）1/1000、anti-FTH1（Mybiosource, #MBS9606937）1/1000、anti-FTL（Atlas, # HPA041602）1/1000、anti-HMGCS1（Proteintech, # 17643-1-AP）1/1000、anti-SQLE（Proteintech, #12544-1-AP）1/1000、anti-HIF1α（Cell Signalling, #36169T）1/1000、anti-PHD2（Novus Biologicals, #NB100137）1/1000、anti-MTCO1（Abcam, #ab14705）1/1000、anti-Cytochrome C（Abcam, #ab110325）1/1000。第二天，膜用TBSt洗涤三次后，与Li-COR二抗在封闭缓冲液中室温孵育1小时。膜再次用TBSt洗涤三次后，蛋白质使用Li-COR Odyssey检测。图像使用fiji分析。

RNA分离、cDNA合成和RT-qPCR通过用冰预冷PBS洗涤细胞后，用TriReagent裂解完成。mRNA使用Direct-zol RNA micro prep（Zymo Research, #R2062）纯化，浓度使用Nanodrop测量。cDNA使用ZymoScript RT PreMix kit（Zymo Research, #R3012）合成。定量实时PCR（RT-qPCR）使用quantstudio 12K Flex Real-Time PCR System进行，反应使用PowerUp SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems, #A25741）按照制造商指南完成。基因表达水平以β-actin表达标准化。

RNA测序通过用冰预冷PBS洗涤细胞后，用TriReagent裂解完成。mRNA使用Direct-zol RNA micro prep纯化，浓度和完整性使用RNA ScreenTape system测量。高质量mRNA使用QIAseq UPXome RNA Library（polyA）进行文库制备，并在NovaSeqX_25B_UpTo300上进行批量测序。原始配对端FASTQ文件使用fastqc进行初始质量评估，随后使用trimmomatic（v0.39）修剪Illumina适配器序列和低质量碱基，确保仅保留高质量读数用于下游分析。清理后的读数使用star aligner（v2.7.10a）在Singularity容器内与人类参考基因组（GRCh38/hg38）比对。star使用默认参数和--quantMode TranscriptomeSAM选项运行，产生转录组比对读数用于下游定量。基因和转录本水平表达使用rsem（v1.3.3）定量。rsem在配对端模式下执行，以star转录组比对读数作为输入，生成原始读数和标准化表达值（transcripts per million, TPM）。所有步骤（fastqc、trimmomatic、star和rsem）的质量控制报告使用MultiQC聚合，以提供数据质量的全面概述。最后，下游分析—包括差异表达测试、通路富集分析、无监督聚类和数据可视化—使用OmicsPlayground平台（v2.8.19）以FDR=0.05完成。热图使用Heatmapper生成。MCL聚类（膨胀参数=1.5）和DBSCAN聚类（epsilon=15）使用string V.12.0生成。

用于MRI和荧光成像的细胞沉淀制备通过培养GSCs和HEK293T细胞至80%汇合度后完成。细胞用0.9 mM Mn(III) Protoporphyrin IX chloride（MnPP）在9% DMSO和91% GSC培养基中、10 μM Zn(II) Mesoporphyrin IX（ZnMP）在9% DMSO和91% GSC培养基中、或9% DMSO（作为阴性对照）和91% GSC培养基处理，并在37°C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育1小时。孵育后，细胞用Accutase解离，300 g离心5分钟。所得细胞沉淀用10 mL PBS重悬洗涤。共进行四次洗涤，随后细胞计数并重悬于100 μL PBS中。细胞悬液转移到300 μL微量离心管中，最终细胞沉淀通过离心获得。沉淀立即置于冰上，并在同一天成像。

细胞沉淀的近红外荧光成像使用Pearl Trilogy Small Animal Imaging System在685 nm激发波长和820 nm检测波长以及白光源170 μm分辨率下完成。图像使用image studio software分析，手动绘制ROI。

磁共振成像（MRI）在7 Tesla下使用40 mm直径Millipede正交体积线圈进行¹H发射和接收。为了确定沉淀中的水质子T₁，使用反转恢复快速低角度射击（FLASH）序列，该序列经过修改以包括非切片选择性绝热反转脉冲，用于快速T₁映射少数切片，使用以下反转时间：0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3和4秒。T₁使用vnmrj 3.1.A软件确定。弛豫率R₁通过取T₁的倒数计算，使用matlab完成。通过以下公式和先前确定的Mn-PP的弛豫性r₁，推断沉淀中的对比剂浓度。

基因沉默通过使用Lipofectamine RNAiMAX Transfection reagent将GSCs转染靶向PHD2（Santa Cruz Biotechnology, #sc-45537）、HIF1a（Santa Cruz Biotechnology, #sc-35561）或对照（Santa Cruz Biotechnology, #sc-37007）的siRNA完成。Lipofectamine转染两天后，收集细胞进行RT-qPCR分析或Western blot分析以确认基因和蛋白质敲低，或使用Adaptaquin单独或与铁螯合剂联合处理两天进行细胞毒性分析。

慢病毒制备和稳定基因工程GSC细胞系通过用于过表达PHD2、HIF1a和GFP的慢病毒质粒：pLV[Exp]-Puro-CBh>hEGLN1[NM_022051.3]/HA、pLV[Exp]-Puro-CBh>hHIF1A[NM_001243084.2]/HA、pLV[Exp]-Puro-CBh>EGFP由VectoBuilder构建。HEK293T细胞在多聚-D-赖氨酸包被的培养板上培养，使用DMEM/F12添加10%胎牛血清培养基。当HEK细胞达到80%汇合度时，通过使用Lipofectamine 2000 Transfection reagent转染第二代慢病毒包装质粒（VSV.G: Addgene, Plasmid #14888和psPAX2: Addgene, Plasmid #12260）生成慢病毒。转染第二天，培养基更换为GSC培养基，细胞在37°C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育24-48小时。孵育后，收集培养基，通过1000 g离心10分钟去除漂浮细胞。上清液通过0.45 μm syringe filter过滤以去除细胞碎片。含有慢病毒颗粒的上清液-80°C冷冻或直接用于GSCs。GSCs在层粘连蛋白包被的培养瓶中用GSC培养基培养。当细胞达到40-50%汇合度时，培养基更换为50%新鲜GSC培养基和50%含有慢病毒颗粒的上清液，并在37°C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育3天。孵育后，培养基更换为添加1 μg·mL^?1 puromycin的GSC培养基。细胞在添加puromycin的GSC培养基中维持1-2周，直到培养中无漂浮死细胞或可观察到的细胞毒性。对基因工程GSCs进行RT-qPCR分析和Western blot分析以确认PHD2或HIF1a的过表达。细胞随后在含有10% DMSO的GSC培养基中液氮保存。

所有插图使用Adobe Illustrator CC 21.1.0、powerpoint V 16.94或BioRender在学术许可条款下创建。

所有数据表示为平均值±标准误。使用graphpad software进行双尾未配对Student's t检验和/或单因素ANOVA显著性检验。，P < 0.05；，P < 0.01；，P < 0.001；ns，不显著。RNA测序分析使用错误发现率（FDR）0.05分析。

结果

3.1 Adaptaquin对胶质瘤干细胞具有选择性细胞毒性

为了探索AQ诱导GSCs死亡的能力，我们处理了患者来源的GSC系（WHO IV级，IDH野生型），这些细胞系被分类为经典型（E22）、前神经型（E25）或间充质型（E53），使用几种浓度的AQ处理2天。如图所示，AQ（高达4 μM）降低了所有GSCs亚型的活力。对