间充质干细胞递送TCR双特异性蛋白：实现肺癌高效清除的创新策略

本综述系统阐述了T细胞受体（TCR）双特异性蛋白通过间充质干细胞（MSCs）进行肺部靶向递送的新范式。研究证实该联合疗法在肺癌治疗中兼具显著疗效（有效清除抗原阳性肿瘤细胞）与良好安全性（避免全身性免疫过度激活），并通过细胞因子（IL-7/IL-21）组合策略成功解决肿瘤异质性难题，为实体瘤免疫治疗提供了突破性解决方案。

　　

ABSTRACT

T细胞受体（TCR）双特异性蛋白代表了一种创新治疗模式，它利用TCR固有的多样化靶点识别能力，同时保留蛋白质疗法的优势特性。然而针对肺部疾病的TCR双特异性蛋白研究仍十分有限。本研究旨在阐明其在肺癌治疗中的潜力。通过人源化小鼠模型评估显示，TCR双特异性蛋白在体内能有效清除肺肿瘤。针对多种肺癌细胞系的细胞毒性实验表明其具有显著杀伤活性。为规避全身给药导致的毒副作用，研究探索了间充质干细胞（MSCs）作为靶向递送载体的可行性。结果显示MSCs具有优异的肺部靶向特性，能在肺内滞留超过7天。通过MSCs局部分泌TCR双特异性蛋白，可在小鼠模型中达到与全身给药相当的治疗效果，且未出现免疫过度激活现象。此外，细胞因子组合筛选表明IL-7、IL-21与TCR双特异性蛋白联用，能显著增强其在异质性肿瘤模型中清除抗原阴性细胞的能力。这些发现共同表明，TCR双特异性蛋白与MSCs的联合疗法在肺癌临床治疗中具有重要应用前景。

1 Introduction

肺癌是全球最常见且致死率最高的恶性肿瘤之一，五年生存率低于20%。其高发病率与吸烟、环境污染、职业暴露和遗传易感性等多种风险因素密切相关。肺部丰富的血管供应和复杂毛细血管网络也使其成为其他部位肿瘤转移的主要靶器官。近年来，PD-1和CTLA-4等免疫检查点抑制剂在肺癌治疗中显示出显著疗效，但总体反应率仅约20%，且伴随免疫相关性肺炎、胃肠道出血、皮肤皮疹和内分泌紊乱等不良反应。这凸显了对更有效、精准治疗策略的迫切需求。

TCR双特异性蛋白是一类创新疗法，将工程化TCR与T细胞招募结构域（通常是CD3抗体）相结合。与传统双特异性抗体仅识别细胞表面抗原（约占总蛋白10%）不同，TCR双特异性蛋白能靶向主要组织相容性复合体（MHC）分子呈递的细胞内抗原，理论上可识别90%的蛋白靶点。且TCR对低丰度抗原的敏感性高于抗体，在实体瘤治疗中具有显著优势。目前针对gp100、HBV、HIV、Survivin和KRAS_G12D等靶点的TCR双特异性蛋白已在临床前模型中验证有效性。Immunocore公司开发的tebentafusp已成为FDA批准治疗葡萄膜黑色素瘤的药物。

尽管TCR双特异性蛋白被认为比CAR-T和TCR-T等基因工程细胞疗法副作用更轻，但tebentafusp的临床数据显示不良事件发生率接近90%，包括细胞因子释放综合征、皮疹和发热，且约30%患者在治疗6-9周后产生抗药物抗体。这些系统性蛋白给药带来的挑战凸显了优化给药方式的必要性。

间充质干细胞（MSCs）因来源丰富、安全性良好、肺部靶向递送能力和合适的药物滞留时间而被广泛应用于临床。本研究验证了TCR双特异性蛋白对肺肿瘤的强大清除活性及其显著毒副作用，进而将双特异性蛋白与MSCs整合实现肺部靶向递送。MSCs的基因可操作性还允许其携带额外治疗载荷，以应对复杂治疗挑战。

2 Materials and Methods

2.1 Cell Culture

A549、H1299、SW480、HEK293T、BEAS-2B和4T1细胞系购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC），Calu6细胞系购自Servicebio科技有限公司。所有细胞在37°C、5% CO₂条件下培养，并定期进行支原体检测。

脐带间充质干细胞（UC-MSCs）采用组织块贴壁法从新生儿脐带中分离，通过流式细胞术确认表面标志物CD73(+)、CD90(+)、CD105(+)、CD34(?)、CD45(?)和HLA-DR(?)。人外周血单个核细胞（PBMCs）通过密度梯度离心从健康供体外周血中分离。

2.2 Recombinant Protein Production

NYESO1和KRAS_G12D特异性TCR序列来自已发表文献。TCR双特异性蛋白由可溶性TCR β链、可溶性TCR α链与CD3重链的融合蛋白以及CD3轻链组成。这些基因片段克隆到pcDNA3.4载体中，重组蛋白在Expi293细胞中生产。

2.3 Generation of Stable Cell Lines

为构建稳定分泌TCR双特异性蛋白的MSCs，将TCR双特异性蛋白的三个组分通过2A自切割肽连接并克隆到慢病毒载体中。通过慢病毒转导获得稳定细胞系，并通过流式细胞术或Western blot分析确认转基因表达。

2.4 Analysis of Target Cell Lysis Rate

通过测量靶细胞的荧光素酶活性间接评估T细胞对靶细胞的细胞毒性效应。靶细胞通过慢病毒转导荧光素酶报告基因（萤火虫荧光素酶或海肾荧光素酶）。与PBMCs共培养72小时后，加入150 μg/mL荧光素酶底物，使用化学发光仪测量生物发光强度。杀伤率计算公式为：%杀伤率 = (单独靶细胞组 - 实验组)/单独靶细胞组 × 100。

2.5 T Cell Functional Analysis

采用ELISA方法检测活化T细胞分泌的IFN-γ、IL-2和TNF-α细胞因子，试剂盒由BD Bioscience提供。通过流式细胞术评估T细胞活化后膜蛋白CD137的上调情况。

2.6 Animal Experiments

在人源化小鼠模型中使用5周龄免疫缺陷（NCG品系）小鼠。通过尾静脉注射600万肿瘤细胞建立转移性肺癌模型。肿瘤植入后第3天或第10天，通过尾静脉注射3000万人T细胞建立人源化免疫系统，并腹腔注射40万单位IL-2支持T细胞生长。TCR双特异性蛋白或工程化MSCs在T细胞回输当天通过尾静脉注射给药，剂量分别为每只小鼠100 μg TCR双特异性蛋白或60万工程化MSCs。转导了荧光素酶报告基因的肿瘤细胞可通过体内成像监测肺内肿瘤生长。实验终点采用颈椎脱位法处死小鼠，收集相关器官进行分析。

2.7 Statistical Analysis

使用Student's t检验或单因素ANOVA进行统计分析，使用GraphPad Prism 8.0软件完成。

3 Results

3.1 TCR Bispecifics Effectively Activate T Lymphocytes to Eliminate Lung Cancer Cells

为评估TCR双特异性蛋白的功能活性，研究首先建立了人外周血单个核细胞（PBMCs）与肺癌细胞的体外共培养模型。使用了两种先前表征的高亲和力TCR：一种靶向癌睾抗原NYESO1（A02:01限制性，克隆1G4_113，K_d = 0.026 nM），另一种靶向肿瘤特异性KRAS_G12D突变（A11:01限制性，克隆JDIa41b1，K_d = 0.74 nM）。重组蛋白在HEK293细胞中表达，SDS-PAGE证实其能自发组装成三聚体。

选择A549、Calu6和H1299三种不表达NYESO1或KRAS_G12D突变的肺癌细胞系作为靶标，通过慢病毒转导引入相应基因和HLA-A分子。在PBMCs与肺癌细胞的共培养模型中，添加不同浓度TCR双特异性蛋白后评估靶细胞死亡率。结果显示TCR双特异性蛋白显著增强PBMCs对抗原表达肺癌细胞的细胞毒性，而对缺乏抗原的细胞无影响，表现出高度特异性。

3.2 TCR Bispecifics Significantly Enhance T Lymphocyte Clearance of Lung Tumors but Are Associated With Notable Systemic Side Effects

为进一步研究TCR双特异性蛋白的体内活性，建立了使用SW480癌细胞系的人源化小鼠肺癌模型。该细胞系能通过血流转移至肺部，并表达HLA-A02:01和NYESO1。通过尾静脉注射确保癌细胞在全身循环系统中传播，在小鼠肺和肝脏形成大量转移灶，发生率为100%。

评估第3天和第10天注射人T细胞的效果显示，早期过继性细胞转移（ACT）能有效控制肿瘤生长，而晚期ACT几乎无效，疾病进展与未治疗组相似。这表明肿瘤负荷对免疫治疗效果有显著影响。选择植入后第10天进行后续实验。

在ACT同时给予TCR双特异性治疗，持续体内肿瘤追踪和肺组织病理学检查证明能有效清除肺肿瘤和肝转移灶，表明TCR双特异性蛋白具有强大的免疫激活能力。但在治疗结束时观察到小鼠体重显著减轻和衰老迹象，表明TCR双特异性蛋白持续激活免疫细胞也会导致明显副作用。

3.3 TCR Bispecifics Secreted by MSCs Achieve Tumor Clearance Effects Comparable to TCR Bispecific Proteins

假设MSCs的肺部靶向特性可促进TCR双特异性蛋白的局部递送，从而减轻全身给药副作用。首先评估了分泌TCR双特异性蛋白的MSCs的免疫调节作用。通过慢病毒转导将表达载体导入MSCs，Western blot证实细胞上清液中TCR双特异性蛋白的分泌。

将工程化MSCs与人PBMCs和肿瘤细胞共培养，结果显示MSCs-双特异性蛋白表现出与TCR双特异性蛋白相当的免疫激活效果：诱导肿瘤裂解；刺激T细胞分泌活性细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF；增强T细胞活化标志CD137。分析MSCs-双特异性蛋白的最低有效剂量发现，即使0.008:1的比例也足以触发T细胞活化。

3.4 MSCs Secreting TCR Bispecifics Significantly Promote Tumor Regression In Vivo Without Notable Toxic Side Effects

使用小鼠模型进一步评估MSCs-双特异性蛋白的功效。首先验证MSCs的肺部靶向特性：用荧光染料DiR标记MSCs后通过尾静脉注射给小鼠，多个时间点观察显示MSCs主要积聚在肺和肝脏，与先前研究一致，这为利用MSCs向肺系统递送TCR双特异性蛋白提供了理论依据。

建立癌症转移模型后，在肿瘤植入后第9天和第10天分别给予MSCs-双特异性蛋白和人T细胞。体内肿瘤追踪显示MSCs-双特异性蛋白治疗组在整个治疗期间无肿瘤发生，与未治疗组形成鲜明对比。肺组织病理学检查进一步证明MSCs-双特异性蛋白治疗组有效清除了肺和肝肿瘤。重要的是，该治疗组小鼠对治疗耐受良好，研究期间未观察到体重减轻等不良反应。

3.5 Enhancement of T Cell Responses Against Heterogeneous Tumors Through Supportive Cytokines

临床肿瘤通常具有异质性，靶抗原表达可变，使得缺乏这些抗原的肿瘤细胞亚群能逃避免疫介导的 destruction，导致肿瘤复发。研究探讨TCR双特异性蛋白是否能引发足够的旁观者效应来靶向低表达或不表达的肿瘤亚群。

利用RNAi技术构建NYESO-1低表达细胞系，用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶分别标记正常和低表达细胞系以评估存活率。结果显示低表达细胞系对PBMCs和MSCs-双特异性蛋白介导的细胞毒性显著不敏感。但当与正常表达细胞1:1共培养时，低表达细胞对细胞毒性的敏感性恢复至基线水平，表明TCR双特异性蛋白诱导的旁观者效应足以影响低表达肿瘤亚群。

平行研究中利用CRISPR/Cas9技术敲除B2M基因构建MHC缺失细胞系。这些MHC缺陷细胞完全抵抗PBMCs和MSCs-双特异性蛋白介导的细胞毒性，即使与正常表达细胞1:1共培养，在最佳靶向条件下也只显示最小杀伤，表明TCR双特异性蛋白诱导的旁观者效应不足以靶向MHC缺陷肿瘤亚群。

为克服MHC缺陷肿瘤细胞带来的挑战，探索了加入炎症细胞因子以增强旁观者效应。评估了多种白细胞介素和干扰素，包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、TNFα和IFNγ。其中IL-7、IL-15和IL-21显著增强旁观者效应。后续测试这三种细胞因子的组合显示，IL-7加IL-21与TCR双特异性蛋白组合诱导最显著的旁观者效应，且不对非恶性肺上皮细胞产生毒性。多细胞因子分析表明IL-7、IL-21和TCR双特异性蛋白组合更有效促进免疫细胞活化，导致促炎细胞因子（如IFN-γ、IL-8、IL-17、TNFα）水平升高，同时抑制因子（如IL-10）表达降低。

3.6 Designing Controllable Gene Expression Elements to Enhance the Clinical Safety of Engineered MSCs

目标是在工程化MSCs中加入基因表达开关，以便在不良反应（如细胞因子风暴）发生时停止治疗基因表达。优先考虑可由小分子激活的诱导型基因转录或翻译控制元件。

首先评估了MSCs中mRNA转染效率，结果显示MSCs对mRNA转染高度敏感，使用商业转染试剂jetMESSENGER的GFP转导效率超过90%。基于这些结果选择两个系统进一步研究：第一个使用Tet-on转录控制元件，通过慢病毒载体稳定整合到MSCs中，由多西环素启动基因表达；第二个使用工程化poly(A)替代物作为翻译控制元件，以mRNA形式递送到MSCs，用Grazoprevir触发转基因表达。

实验中发现两种方法都能成功实现MSCs中可调控基因表达。最初表达水平相当，但慢病毒系统在基因负载和表达持续时间方面有优势，而mRNA介导的表达仅维持约6天。两种转导方法都能产生足够的TCR双特异性蛋白分泌，足以引发免疫反应。

4 Discussion

免疫治疗的快速发展凸显了优化疗效与安全性平衡的迫切需求。靶点选择的多样性和特异性是TCR疗法的基础优势，体现了其在解决实体瘤方面的独特潜力。传统TCR靶点包括肿瘤相关抗原（TAAs）、新抗原和病毒抗原。在TAAs中，NY-ESO-1因其良好的安全性和强大的治疗潜力受到广泛关注，大多数研究集中在软组织肉瘤，肺癌研究相对有限。NY-ESO-1在11.8%-21%的非小细胞肺癌（NSCLC）病例中呈阳性表达，表明其适用于部分患者。除了TAAs，源自体细胞突变（如KRAS突变）的新抗原是理想的TCR靶点。KRAS突变在各种恶性肿瘤中普遍存在，包括30%的NSCLC病例，热点突变主要位于G12位置。

与基因修饰细胞疗法相比，双特异性T细胞接合剂（BiTEs）具有明显优势：降低生产成本、稳定药理学特征和增强临床可及性，使其在特定治疗背景下成为有前景的替代方案。然而BiTEs在实体瘤中的发展仍因寻找最佳靶点的挑战而受阻。且蛋白质疗法固有的短半衰期使维持肿瘤微环境中的有效浓度复杂化。BiTEs通常包含CD3抗体结构域以激活T细胞，但其给药需要精细的剂量控制以减轻全身免疫激活。

当前优化策略包括：降低CD3抗体结构域的亲和力；整合条件性激活机制；采用递送平台（如溶瘤病毒、脂质纳米颗粒或工程化细胞系统）以促进BiTEs或其mRNA有效载荷向肿瘤部位的精准递送。本研究引入MSCs介导的BiTE递送平台，利用MSCs的肺部归巢特性实现靶向药物递送和持续释放，显著提高靶器官内的局部药物浓度，同时最小化全身暴露，从而减轻不良反应。临床前动物模型证明MSCs递送系统达到与静脉蛋白给药相当的治疗效果，且毒性显著降低，转化潜力强。

免疫治疗的一个关键考虑是临床环境中肿瘤抗原的异质性表达，这使得单靶点治疗不足以解决肿瘤异质性。当代治疗模式（包括CAR-T、TCR-T和单克隆抗体疗法）主要依赖单靶点范式。然而缺乏这些靶点的肿瘤亚群能逃避免疫监视，导致复发——这是CAR-T治疗失败中经常观察到的限制。为克服这一挑战，扩大治疗靶点库已成为可行策略，包括开发双靶点或多靶点CAR-T细胞，或工程化具有先天细胞毒性活性的免疫细胞亚群（如CAR-NK或CAR-NKT细胞）。加入支持性细胞因子（如白细胞介素和干扰素家族成员）以放大免疫介导的细胞毒性是另一种有前景的方法。

尽管MSCs在肿瘤学中具有巨大治疗潜力，但其双重性带来重大挑战。MSCs在肿瘤微环境中显示情境依赖性效应：可能激活免疫反应或递送抗癌剂抑制恶性肿瘤；也可能通过促进免疫抑制条件或支持肿瘤相关基质来促进肿瘤进展。这种动态行为需要仔细评估肿瘤微环境因素（如T细胞浸润）以选择适合MSCs干预的患者。在免疫"冷"肿瘤（特征为免疫细胞浸润有限）中，MSCs可能无法引发免疫激活，反而分泌促肿瘤因子，促进肿瘤存活和增殖。此外，MSCs的致癌风险仍是一个关键问题。MSCs可能通过异常分化或与肿瘤细胞直接相互作用促进肿瘤发生。严格的质量控制措施至关重要，包括 rigorous筛选MSCs来源、确保基因组稳定性以及防止污染或异常细胞扩增。为减轻MSCs基于疗法固有的遗传风险，非整合性基因编辑技术（如基于mRNA的方法）日益突出。与传统病毒载体不同，mRNA修饰避免基因组整合，提供瞬时且可控的基因表达，显著降低致癌潜力。

总之，TCR基于双特异性蛋白与MSCs介导的递送系统的融合代表了肺部疾病治疗的新范式。虽然肿瘤学仍是TCR基于疗法最成熟的领域，但其他治疗领域也值得探索，包括选择性清除病毒感染的细胞、纤维化成纤维细胞或衰老细胞。这些目前正在为CAR-T平台研究的应用同样可能受益于TCR基于双特异性蛋白或工程化MSCs作为最佳治疗解决方案。