脂质体铼-188联合巨噬细胞清除增强抗PD-L1疗效及B细胞浸润以对抗肺癌转移

本研究探讨了脂质体包裹的Rhenium-188（Lipo-Re188）联合巨噬细胞清除（Lipo-clod）及PD-L1阻断在肺转移癌治疗中的协同作用。通过调节单核吞噬系统（MPS）介导的清除，显著提高Lipo-Re188在肿瘤微环境（TME）中的蓄积，并重塑免疫细胞组成（如增加B细胞和功能性T细胞，抑制MDSC），为放射性药物与免疫治疗的联合策略提供了新见解。

　　

ABSTRACT

放射性核素如Rhenium-188（Re188）因其细胞毒性作用及激活全身抗肿瘤免疫的潜力，在转移癌治疗中展现出前景。然而，单核吞噬系统（MPS）对脂质体包裹Re188（Lipo-Re188）的清除限制了其肿瘤递送。本研究旨在通过巨噬细胞清除和免疫检查点阻断增强Lipo-Re188对肺转移的治疗效果。通过静脉注射CT26-荧光素酶细胞建立肺转移结肠癌模型，并给予Lipo-Re188（11.1 MBq，为最大耐受剂量MTD的30%）、脂质体氯膦酸盐（Lipo-clod）以清除巨噬细胞，和/或抗PD-L1抗体治疗。通过生物发光成像监测肿瘤进展，并在注射后1、24和48小时评估核素生物分布。流式细胞术用于分析脾脏和肿瘤微环境（TME）中的免疫细胞群体。细胞因子水平通过微球多重检测及流式细胞术分析。巨噬细胞清除显著增强了Lipo-Re188的肿瘤蓄积，同时减少肝脏摄取并延长生存期。Lipo-clod与Lipo-Re188联用促进了B细胞，恢复了功能性T细胞，并抑制了脾脏和TME中的MDSC。值得注意的是，联合治疗组中IL-1α和GM-CSF水平显著升高。Lipo-clod、Lipo-Re188与抗PD-L1的三联疗法提供了最佳的生存获益、最高的瘤内B细胞蓄积和最低的间质巨噬细胞水平，且无显著生物毒性。本研究揭示三联疗法可克服免疫抑制反馈并促进肿瘤抑制微环境。这些发现支持将放射性药物疗法与免疫调控相结合以治疗转移癌的合理联合策略。

1 Introduction

放射性核素的施用可实现电离辐射的全身递送，不仅直接靶向播散肿瘤细胞，还能调节系统免疫。脂质体包裹的核素是癌症治疗、自身免疫性疾病和再生医学中广泛应用的递送策略。脂质体脂质双层为治疗剂（包括核苷酸）提供结构保护，并作为抗体偶联和表面修饰的通用平台以实现靶向递送。Rhenium-188（Re188）因其适中半衰期（16.9小时）、高β粒子发射能量（2.11 MeV）、足够的组织穿透范围（约11毫米）以及经济高效的发生器生产方式，是一种有前景的用于恶性肿瘤治疗的诊疗一体化核素。除治疗能力外，Re188同时发射β粒子和γ射线，适于成像和生物分布追踪。脂质体包裹的Re-188（Lipo-Re188）被开发用于改善肿瘤特异性递送和治疗效果，其疗效已在头颈、肺、肝、胰腺、卵巢和结肠癌的临床前模型中得到证实。Lipo-Re188通过增强通透性和滞留（EPR）效应——以异常血管、受损淋巴引流和升高间质压力为特征——在肿瘤微环境（TME）中蓄积，并向癌细胞递送局部β辐射。此外，Re188标记分子（包括肽、抗体、Lipiodol和颗粒）已在早期临床试验中评估，如原发性肿瘤、骨转移、类风湿关节炎和血管内介入。放射性核素治疗的免疫影响日益被认为是疗效的决定因素，并受辐射类型、剂量、递送动力学和TME免疫组成等因素影响。在肿瘤中，辐射诱导免疫原性细胞死亡（ICD），促进损伤相关分子模式（DAMP）释放、干扰素基因刺激因子（STING）通路激活和MHC I类分子上调。这些事件支持抗原呈递和树突状细胞激活，最终促进CD8⁺ T细胞启动和系统抗肿瘤免疫。此外，辐射可重塑系统细胞因子环境——提升IFN-β、IL-6和TNF-α——从而促进免疫细胞招募和激活。然而，亚致死辐射也可能短暂改变免疫亚群平衡，包括T细胞、NK细胞、调节性T细胞（Tregs）和髓源性抑制细胞（MDSC），进而影响免疫刺激和免疫抑制反应。MDSC包括两个主要亚群：多形核MDSC（PMN-MDSC），与中性粒细胞共有表型和功能特征；和单核细胞MDSC（M-MDSC），类似于单核细胞。两个亚群均发挥强免疫抑制效应，共同构成TME内限制T细胞激活和效应功能的最强细胞群体之一。总体而言，放射性核素治疗不仅向肿瘤递送治疗性照射，还启动了一系列系统免疫事件，可克服转移癌中的免疫抵抗。

与游离Re188相比，Lipo-Re188表现出显著不同的药代动力学、生物分布和免疫学相互作用。Lipo-Re188呈现延长系统循环、增加肿瘤蓄积和单核吞噬系统（MPS）优先摄取。MPS——包括肝Kupffer细胞、脾巨噬细胞和骨髓吞噬细胞——在脂质体清除中起关键作用，是脂质体放射治疗剂有效递送的主要障碍。高MPS摄取引起对脱靶辐射暴露、肝毒性、脾功能障碍和系统细胞因子平衡扰动的担忧。MPS摄取受脂质体物理化学性质影响，如尺寸、表面电荷和调理作用。PEG化纳米脂质体（约100纳米）通过减少吞噬摄取和增强肿瘤特异性外渗提供优势。然而，核素在MPS巨噬细胞内的细胞内衰变可能损害吞噬功能和免疫稳态，潜在加剧重复治疗期间的免疫毒性。当前关于脂质体核素治疗免疫调节效应的文献仍有限，潜在机制和临床意义尚待明确。

本研究采用低剂量PEG化Lipo-Re188与通过脂质体氯膦酸盐（Lipo-clod）的巨噬细胞清除的组合策略以调节Lipo-Re188生物分布并降低肝毒性。通过减弱MPS介导的清除，我们假设Lipo-Re188在TME中的蓄积将增加，增强治疗效果。然而，Lipo-clod治疗据报道可升高循环中性粒细胞，这可能因中性粒细胞上高PD-L1表达而限制抗肿瘤疗效。为克服此，我们进一步实施PD-L1免疫检查点阻断作为第三治疗组分。本研究提供了对脂质体核素治疗如何调节系统和局部免疫的机制理解，并突出最大化疗效同时最小化脱靶效应的合理组合策略。

2 Material and Methods

2.1 Cell Culture

小鼠结肠腺癌细胞系CT26购自美国模式培养物集存库（ATCC），并在补充10%热灭活胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中于标准培养条件（37°C，5% CO₂）下维持。为体内生物发光成像，用编码北美萤火虫荧光素酶基因的慢病毒载体生成稳定表达荧光素酶的克隆（CT26-luc），并使用400 μg/mL G418进行筛选。

2.2 Preparation of PEGylated Liposomal Re188

Nano-X PEG化脂质体（平均直径：82.59纳米）由氢化大豆磷脂酰胆碱（HSPC）、胆固醇和DSPE-PEG2000以摩尔比3:2:0.3组成。脂质体内水相含250 mM硫酸铵（pH 5.0）。总磷脂浓度经磷酸定量测定为13.16 mM。Re-188通过洗脱无载体¹⁸⁸W/¹⁸⁸Re发生器用无菌盐水生产高锝酸钠（NaReO₄）。核素在葡萄糖酸钠和氯化亚锡存在下与N,N-双(2-巯基乙基)-N',N'-二乙烯二胺（BMEDA）螯合。简单来说，3 mg BMEDA与0.34 M葡萄糖酸钠在10%乙酸溶液中混合，随后加入0.02 M氯化亚锡二水合物。加入Re188溶液并在80°C孵育1小时。使用即时薄层色谱硅胶（ITLC-SG）以生理盐水为流动相评估放射性标记效率（Rf：Re188 = 0.8–1.0；Re188-BMEDA = 0.0–0.2）。脂质体加载前，用2 N NaOH将Re188-BMEDA复合物pH调至7.0。放射性标记复合物与PEG化脂质体在60°C孵育30分钟以促进包裹。使用PD-10脱盐柱分离游离Re188-BMEDA，并以分离后与脂质体相关的放射性百分比计算标记效率。Lipo-Re188展示放射化学纯度98.5%、比活度63.2 MBq/μmol、粒径83.7纳米、Zeta电位-1.1 mV和24小时血浆稳定性88.03%。

2.3 Experimental Animal Model

雄性BALB/c小鼠（4周龄）购自国家实验动物中心。所有实验程序经马偕纪念医院机构动物护理和使用委员会（MMH-A-S-108-25）批准并符合机构和国际动物福利指南。为建立肺转移模型，每只小鼠尾静脉注射1×10⁶ CT26-luc细胞悬浮于50 μL PBS。肿瘤发展通过腹腔注射D-荧光素（150 mg/kg）后使用IVIS Spectrum成像系统监测。接种后第7天显示相当发光信号的小鼠随机分入治疗组。脂质体氯膦酸盐（Lipo-clod；2 μm）通过尾静脉注射以50 mg/kg剂量在核素给药前2天施用。小鼠接受单次静脉注射Lipo-Re188于亚治疗剂量11.1 MBq（最大耐受剂量30%；每鼠100 μL）。为组合免疫治疗，抗PD-L1单克隆抗体在Lipo-Re188治疗后第0、2和4天以7.5 mg/kg腹腔注射。全程监测小鼠体重、白细胞、肝肾功能和生存。

2.4 Bio-Distribution of Liposomal Re188

携带CT26-luc细胞的肺转移小鼠静脉注射2.22 MBq Lipo-Re188，伴或不伴脂质体氯膦酸盐治疗。小鼠在注射后1、24和48小时通过CO₂窒息处死，取出感兴趣器官、清洗和称重。使用Auto-Gamma计数器检测Lipo-Re188放射性，数据表示为每克组织注射剂量百分比（% ID/g）。

2.5 Hemogram and Biochemistry

使用血液分析仪测量白细胞（WBC）计数。血浆通过2000 g离心10分钟分离并用于生化分析。使用Fuji Dri-Chem slide assays测定转氨酶（ALT）和肌酐（CRE）水平。

2.6 Flow Cytometry Analysis

小鼠通过肌注氯胺酮（100 mg/kg）和甲苯噻嗪（10 mg/kg）安乐死。取脾和肺并用胶原酶A（1.5 mg/mL）和DNase I（0.4 mg/mL）在37°C酶消化30分钟。细胞悬液通过70 μm滤器过滤，红细胞用ACK缓冲液裂解。Fc阻断后，用一组荧光染料偶联单克隆抗体在冰上染色20分钟。使用13色流式细胞仪立即分析细胞并使用分析软件量化。免疫亚群定义为：PMN-MDSC（CD11b⁺/Ly6G⁺）、M-MDSC（CD11b⁺/Ly6C⁺⁺）、CD4⁺ T细胞（CD11b^?/CD3⁺/CD8^?）、CD8⁺ T细胞（CD11b^?/CD3⁺/CD8⁺）、NKT细胞（CD11b^?/CD3⁺/NKG2D⁺）、自然杀伤细胞（CD3^?/MHCII^?/NKG2D⁺）、B细胞（CD11b^?/MHCII⁺/CD11c^?）、脾巨噬细胞（CD11b^m/MHCII⁺/F4/80⁺）、肺泡巨噬细胞（CD11b^m/Siglec F⁺/CD11c⁺）、间质巨噬细胞（CD11b⁺/MHCII⁺/F4/80⁺）、树突状细胞（MHCII⁺/CD11c⁺）和嗜酸性粒细胞（CD11b⁺/Siglec F⁺/F4/80⁺）。

2.7 Cytokine Detection

使用LEGENDplex Mouse Inflammation Panel（13-plex）定量血浆细胞因子。面板包括IL-23、IL-1α、IFN-γ、TNF-α、MCP-1、IL-12p70、IL-1β、IL-10、IL-6、IL-27、IL-17A、IFN-β和GM-CSF。样品在13色流式细胞仪上分析，数据使用分析软件处理。

2.8 Statistical Analysis

数据使用GraphPad Prism分析。结果表示为均值±标准差（SD）。两组比较，正态分布数据用非配对t检验，非参数数据用Mann–Whitney U检验。多重比较时，方差齐用单因素ANOVA与Tukey事后检验；否则用Welch ANOVA或Kruskal–Wallis检验与Dunn校正。生存数据用log-rank（Mantel–Cox）检验分析。p值<0.05视为统计显著。

3 Results

3.1 Macrophage Depletion Enhances Therapeutic Efficacy of Lipo-Re188

为增强脂质体核素治疗的治疗指数并减少脱靶效应，我们采用脂质体氯膦酸盐（Lipo-clod）的巨噬细胞清除策略。通过静脉注射CT26-荧光素酶（CT26-luc）结肠癌细胞建立肺转移模型。接种后第7天通过体内成像系统（IVIS）评估肿瘤负荷，小鼠随机分六组：正常（无肿瘤）、转移对照、脂质体、Lipo-clod、Lipo-Re188和Lipo-clod + Lipo-Re188组合。基于先前发现，Lipo-Re188在BALB/c小鼠中的最大耐受剂量（MTD）为37 MBq。本研究施用单次静脉剂量11.1 MBq（MTD的30%）于Lipo-Re188和组合组。Lipo-clod静脉给药在2天内有效抑制巨噬细胞，代表组合治疗的最佳窗口。因此，Lipo-clod在Lipo-Re188前2天静脉注射。IVIS分析显示巨噬细胞预先清除显著增强Lipo-Re188的肿瘤抑制效应相比脂质体对照组。中位生存从脂质体组的21天延长至Lipo-Re188单药的31天，并进一步至组合治疗的37天。关于系统毒性，监测体重、白细胞（WBC）计数和肝（ALT）、肾（CRE）功能指标。各组体重无显著变化。Lipo-clod和Lipo-Re188治疗均在治疗后第5和10天短暂降低WBC计数，第15天恢复。对照小鼠20%在第15天检测到ALT轻度升高，而组合治疗未显著改变ALT水平相比对照。CRE水平在所有组保持正常范围。总之，这些结果表明巨噬细胞清除显著增强Lipo-Re188的抗肿瘤效应而不引起显著系统毒性。

3.2 Macrophage Depletion Increases Tumor Accumulation of Lipo-Re188

为评估巨噬细胞清除对Lipo-Re188生物分布的影响，在CT26-luc携带小鼠多时间点测量组织放射性。注射后1小时，Lipo-Re188主要检测于血液（23.29%±2.72% ID/g）。巨噬细胞清除显著增加循环水平（38.37%±13.22% ID/g）。值得注意的是，Lipo-clod预处理导致脾蓄积增加4倍（34.61%±12.54% vs. 8.06%±0.61%）。24小时时，Lipo-Re188主要分布于血液、肝和脾。组合治疗升高脾摄取（28.78%±7.48% vs. 12.20%±1.99%）并减少肝蓄积（4.29%±1.11% vs. 11.45%±3.70%）。此趋势持续至48小时，组合组相比单独Lipo-Re188显著增加脾保留、减少肝摄取和更高血液水平。重要的是，巨噬细胞清除显著增加肺中Lipo-Re188水平（5.11%±1.03% vs. 2.36%±0.46%），且肿瘤与肌肉摄取比从13.89改善至23.22。这些数据表明巨噬细胞消除延长Lipo-Re188系统循环，增强肿瘤靶向，减少肝扣押，以及改善治疗效果和肝毒性。

3.3 Lipo-Re188 Modulates Splenic Immune Profile Following Macrophage Depletion

为评估巨噬细胞清除和Lipo-Re188治疗对系统免疫的影响，我们使用多色流式细胞术分析五实验组——无肿瘤、脂质体、Lipo-clod、Lipo-Re188和Lipo-clod + Lipo-Re188——中脾脏免疫细胞群体。正常小鼠（无肿瘤组）作为阴性对照以评估肿瘤相关免疫谱改变。检查十种免疫细胞亚群并有清晰分设门：多形核髓源性抑制细胞（PMN-MDSC）、单核细胞MDSC（M-MDSC）、巨噬细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤（NK）细胞、B细胞、自然杀伤T（NKT）细胞、CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞。Lipo-clod治疗有效清除脾巨噬细胞并导致治疗后第16天显著诱导CD4⁺和CD8⁺ T细胞。尽管巨噬细胞清除增加CD8⁺ T细胞比例相比脂质体组，但这些细胞中显著部分表达PD-1，指示耗竭表型。相反，PD-1表达在Lipo-clod治疗后未在CD4⁺ T细胞上調，表明这些细胞保留功能性。Lipo-Re188单药显著增加NK和B细胞群体但同时减少CD4⁺和CD8⁺ T细胞数量相比脂质体组。值得注意的是，组合治疗（Lipo-clod + Lipo-Re188）导致巨噬细胞和NK细胞进一步减少同时挽救CD4⁺和CD8⁺ T细胞群体相对Lipo-Re188单独。耗竭CD8⁺ T细胞（PD-1⁺）在组合组显著减少，表明改善T细胞功能性。虽然Lipo-clod减弱Lipo-Re188诱导的NK细胞增加，B细胞水平在组合治疗后保持升高，甚至超过正常小鼠。此外，PMN-MDSC和M-MDSC群体在治疗后第16天被组合治疗显著抑制。

我们进一步评估治疗后第4天循环炎症细胞因子，发现IL-1α和GM-CSF水平在组合组显著升高相比脂质体或Lipo-Re188组。这些发现表明Lipo-clod + Lipo-Re188治疗增强系统抗肿瘤免疫，伴随升高B细胞、减少MDSC介导的免疫抑制、恢复T细胞功能和促进促炎细胞因子反应。

3.4 Lipo-Re188 Reprograms Tumor Microenvironment Following Macrophage Depletion

肿瘤微环境（TME）是治疗疗效的关键决定因素。为进一步表征局部免疫调节，我们使用流式细胞术分析TME中免疫细胞亚群。量化TME中十种免疫细胞类型：PMN-MDSC、M-MDSC、肺泡巨噬细胞、间质巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、NK细胞、B细胞、NKT细胞、CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞。Lipo-clod治疗有效减少间质巨噬细胞和NK细胞，同时对肺泡巨噬细胞影响最小。尽管CD4⁺和CD8⁺ T细胞在Lipo-clod后升高，CD8⁺ T细胞呈现高PD-1表达，指示耗竭。Lipo-Re188单药导致CD8⁺ T细胞进一步减少，至第16天TME中NK和B细胞无显著增加。重要的是，组合治疗显著增加瘤内CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和B细胞相比Lipo-Re188单独。PD-1⁺ CD8⁺ T细胞在组合组最低，表明细胞毒性T细胞活性恢复。此外，间质巨噬细胞、PMN-MDSC和M-MDSC在组合治疗后显著抑制。总之，这些结果表明Lipo-clod和Lipo-Re188联用通过增强功能性CD4⁺和CD8⁺ T细胞浸润、促进B细胞招募和减少免疫抑制MDSC和巨噬细胞群体重编程TME。TME中这些协调免疫变化可作为与肺转移治疗疗效相关的生物标志物。

3.5 PD-L1 Blockage Enhances Therapeutic Efficacy of Lipo-Re188 After Macrophage Depletion

我们先前工作证明在肺转移小鼠模型中PD-L1阻断比直接PD-1抑制提供更持续PD-1表达抑制。此外，Lipo-Re188治疗在早期时间点显著上调PD-L1表达，提示潜在免疫逃逸机制。基于这些发现，我们选择PD-L1阻断作为组合策略以增强对肺转移的肿瘤控制。IVIS成像评估后，小鼠随机分六组：无肿瘤、脂质体、Lipo-clod+Lipo-Re188、Lipo-clod+抗PD-L1、Lipo-Re188+抗PD-L1和Lipo-clod+Lipo-Re188+抗PD-L1。Lipo-clod在Lipo-Re188注射前2天（第0天）静脉注射，而抗PD-L1抗体（7.5 mg/kg）在Lipo-Re188注射后第0、2和4天腹腔注射。IVIS分析显示Lipo-clod、Lipo-Re188和抗PD-L1的三联组合实现最显著肺肿瘤生长抑制。骨髓抑制在Lipo-Re188、Lipo-clod和抗PD-L1联合治疗后第5天观察到，血液学恢复于第10和15天。各组体重无差异，表明无显著系统毒性。生存分析进一步确认三联疗法显著延长中位生存相比脂质体组。为评估潜在免疫机制，我们分析脾和TME中免疫细胞群体。与先前发现一致，Lipo-clod和Lipo-Re188组合显著增加脾B细胞水平，此效应也在Lipo-Re188+抗PD-L1和Lipo-clod+Lipo-Re188+抗PD-L1组观察到。在TME内，三联疗法导致B细胞显著升高——超过正常小鼠水平——并与增强治疗效果相关。间质巨噬细胞——源自M-MDSC并贡献免疫抑制——在三联治疗组相比脂质体对照显著减少，突出其作为治疗反应生物标志物的潜力。虽然Lipo-clod单独或组合（双或三联方案）增加脾和TME中T细胞水平，这些变化与三联组合治疗疗效无强相关。总之，巨噬细胞预先清除不仅增强Lipo-Re188在TME内蓄积，还促进B细胞招募和减少间质巨噬细胞。重要的是，Lipo-clod/Lipo-Re188后反馈上调PD-L1被PD-L1阻断有效抵消，从而重编程TME为更免疫刺激和肿瘤抑制环境。

4 Discussion

Rhenium-188（Re188）因其高能β发射、适中物理半衰期和经济高效的发生器生产，是一种有前景的诊疗一体化核素。Re-188包裹于脂质体（Lipo-Re188）显著延长系统循环并通过EPR效应促进肿瘤优先蓄积。然而，Lipo-Re188被单核吞噬系统（MPS）特别是肝Kupffer细胞肝清除可能导致肝毒性并限制治疗效果。本研究中，我们证明使用脂质体氯膦酸盐（Lipo-clod）预先清除巨噬细胞增强Lipo-Re188在肿瘤组织和外周血中的蓄积，从而改善肺转移模型中的肿瘤生长抑制。Lipo-clod和Lipo-Re188组合改变生物分布谱，增加脾蓄积三倍并减少肝蓄积一半。尽管巨噬细胞清除后Lipo-Re188在脾和骨髓中蓄积增加，这未导致持续免疫抑制。这些造血器官内免疫细胞群体在后期时间点展现再 populate能力，表明Lipo-Re188短暂暴露不足以诱导不可逆损伤。不同于脾和骨髓，肝免疫和实质细胞在重复核素暴露后的再生反应可能更慢或不完全。这些发现表明免疫系统在低剂量Lipo-Re188治疗后保留再生潜力，从而支持此治疗途径与巨噬细胞清除结合时的安全性。

MPS是一个动态和自我调节网络，协调病原体、凋亡细胞和外源颗粒如纳米粒子和脂质体的清除。Kupffer细胞清除后，启动补偿机制，包括增加骨髓单核细胞衍生抑制细胞（M-MDSC）输出以保留系统吞噬功能。此外，我们观察到Lipo-clod减少不仅巨噬细胞还有M-MDSC、NK细胞、树突状细胞和B细胞，提示更广泛免疫调节效应。新兴数据表明Lipo-clod也被中性粒细胞内化，可能贡献其体内抗炎活性。值得注意的是，Campbell等报道重复皮内注射Lipo-clod在银屑病样小鼠模型中恢复CD8⁺ T细胞数量。本研究中，Lipo-clod显著增加治疗后CD4⁺和CD8⁺ T细胞群体。需要进一步表征以确定这些CD4⁺ T细胞是否包括调节性T细胞亚群。Lipo-Re188单药一致增加脾和TME中NK和B细胞群体。组合治疗导致瘤内B细胞持续升高并有效恢复先前被Lipo-Re188抑制的T细胞群体。这些观察支持Lipo-clod通过重塑免疫景观增强Lipo-Re188抗肿瘤活性的观点， notably增加TME中功能性T和B细胞。先前关于其他β和