整合基因组学揭示细胞衰老驱动的分子网络与免疫互作在近视发病机制中的作用

本综述通过整合转录组数据集（GSE112155和GSE151631），系统解析了近视发病中细胞衰老（Cellular Senescence）相关基因（CSRGs）的核心调控网络。研究首次构建了蛋白质相互作用（PPI）网络及转录后调控轴（mRNA–miRNA–TF），发现TP53、CDKN1A和MYC等关键基因通过调节细胞周期、免疫细胞浸润（如γδ T细胞、自然杀伤T细胞）和凋亡通路，协同驱动近视进展。实验验证表明，基因敲除（Knockout）及过表达（Overexpression）可显著影响眼轴长度和视网膜厚度。该研究为近视作为衰老相关疾病提供了多组学证据，并为靶向免疫-衰老交互作用提供了新型治疗策略。

　　

引言

近视是全球范围内最常见的眼部健康问题之一，约25亿人受其影响。其主要特征为眼轴延长导致的屈光不正，与遗传和环境因素密切相关。近年来，青少年近视发病率急剧上升，已成为重大公共卫生挑战。尽管可通过光学矫正暂时改善视力，但高度近视会显著增加视网膜脱离、黄斑变性和青光眼等严重眼部病变的风险。

细胞衰老是一种由DNA损伤、端粒缩短或氧化应激等因素触发的细胞周期停滞状态，与多种年龄相关疾病密切相关。衰老细胞分泌特定的表型因子，包括促炎细胞因子、生长因子和细胞外基质金属蛋白酶（MMPs），可能导致组织功能障碍。在近视患者中，年龄相关的细胞外基质重塑和炎症信号可能通过调控巩膜和眼轴长度直接影响近视进展。

材料与方法

本研究从GEO数据库获取了GSE112155和GSE151631两个转录组数据集，涵盖近视组和正常视力对照样本。使用GEOquery和limma软件包进行数据合并与批次校正，TPM标准化后筛选差异表达基因（DEGs）。从GeneCards和CellAge数据库获取细胞衰老相关基因（CSRGs），与其交集获得衰老相关差异基因（CSRDEGs）。进行GO、KEGG和GSEA富集分析，使用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并通过Cytoscape的cytoHubba插件识别核心基因。进一步通过miRDB和CHIPBase构建mRNA–miRNA和mRNA–转录因子调控网络。

使用CRISPR/Cas9技术构建Tp53、Cdkn1a和Myc基因敲除小鼠模型，并通过慢病毒载体实现基因过表达。通过光学相干断层扫描（OCT）测量眼轴长度和视网膜厚度，自动验光仪监测屈光状态， slit-lamp和Tonopen进行眼部结构与眼压检测。细胞实验采用人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19），通过siRNA敲低目标基因，CCK-8、流式细胞术和Western blot等技术分析细胞增殖、凋亡与周期变化。

结果

3.1 数据整合与衰老相关基因识别

合并GSE112155和GSE151631数据集并进行标准化处理后，共识别出13935个DEGs。与已知CSRGs取交集后，筛选出29个CSRDEGs，包括ATM、CDKN1A、CDKN2A、MYC、TP53等关键基因。热图显示这些基因在近视组和正常组间存在显著表达差异。

3.2 功能富集分析

GO分析表明，CSRDEGs显著富集于细胞衰老、细胞周期G1/S期转换等生物过程，以及染色体区域、端粒区等细胞组分。KEGG分析提示这些基因参与细胞衰老、细胞周期调控、人类巨细胞病毒感染及多种癌症通路。

3.3 PPI网络与核心基因筛选

PPI网络显示26个CSRDEGs之间存在密切相互作用。通过五种拓扑算法（MCC、closeness、degree、EPC、MNC）筛选出7个核心基因：ATM、EZH2、CDKN1A、CDKN2A、MYC、SIRT1和TP53。GeneMANIA进一步预测这些基因之间存在共表达、共定位和物理相互作用。

3.4 转录后调控网络

通过miRDB数据库预测与7个核心基因相互作用的miRNA，构建了mRNA–miRNA调控网络。同时利用hTFtarget识别出155对mRNA–TF相互作用，表明转录因子可能通过调控衰老相关基因间接影响眼部稳态与近视发生。

3.5 基因表达与免疫浸润分析

组间比较显示，TP53、CDKN1A和MYC在近视组中表达显著上调（p<0.01）。ROC曲线分析表明这三个基因具有较高的诊断价值（AUC 0.8–0.9）。免疫浸润分析发现，γδ T细胞、自然杀伤T（NKT）细胞、中性粒细胞等8种免疫细胞在近视组中浸润水平显著改变。相关性分析提示核心基因表达与免疫细胞浸润水平密切相关。

3.6 基因功能验证：体内实验

成功构建Tp53、Cdkn1a和Myc基因敲除及过表达小鼠模型。qPCR和Western blot验证了基因操作的有效性。眼轴测量显示，Tp53过表达、Cdkn1a和Myc敲除组眼轴延长更显著，而Tp53敲除、Cdkn1a和Myc过表达组延长较缓。视网膜厚度变化与眼轴延长趋势一致。屈光检测表明，基因操作可导致近视或远视偏移。眼部结构观察和眼压检测未发现明显异常。

3.7 基因调控细胞凋亡

H&E染色显示，Tp53过表达、Cdkn1a和Myc敲除组小鼠眼球组织中视网膜增厚、细胞排列疏松，胶原纤维紊乱。TUNEL检测发现这些组别中视网膜细胞凋亡增加。Western blot和qPCR验证凋亡相关蛋白（RIP1、Caspase-8、Caspase-3）表达上调。

3.8 细胞生物学过程影响

在ARPE-19细胞中敲低Tp53、Cdkn1a和Myc后，细胞周期分布发生改变：Tp53敲低导致周期延长，而Cdkn1a和Myc敲低使周期缩短。CCK-8实验表明敲低任一基因均抑制细胞增殖。Myc敲低还导致其下游靶基因Cyclin D1和GLUT表达下降。Caspase-3活性和蛋白水平在所有敲低组中均上升。

3.9 细胞凋亡通路机制

基因敲除显著增加细胞凋亡，Western blot显示RIP1、Caspase-8和Caspase-3蛋白表达上调，而BID水平无显著变化。mRNA表达与蛋白结果一致。通过TNF-α激活NF-κB信号通路后，NF-κB相关蛋白表达发生改变，细胞凋亡水平下降，表明NF-κB激活可逆转衰老基因敲除促凋亡效应。

讨论

本研究首次通过整合基因组学方法系统揭示了细胞衰老在近视发病中的关键作用。核心基因TP53、CDKN1A和MYC通过调控细胞周期、凋亡和免疫浸润等过程，共同促进眼轴延长和近视发展。免疫浸润分析发现γδ T细胞、NKT细胞和中性粒细胞等在近视组织中显著富集，表明局部慢性炎症状态可能参与近视进展。

这些基因通过复杂的转录后调控网络（包括miRNA和转录因子）实现功能协调。MYC通过激活miR-17-92簇等增殖相关miRNA形成正反馈环路，同时受到miR-204的负调控，共同影响细胞增殖、代谢和凋亡过程。

基于这些发现，我们提出“衰老-免疫轴”假说：细胞衰老通过衰老相关分泌表型（SASP）因子诱导异常免疫细胞浸润，激活炎症反应和组织重塑，从而驱动近视进展。类似机制在类风湿关节炎、哮喘和心力衰竭等慢性疾病中已得到证实，支持这一模型的普适性。

结论

本研究通过整合多组学数据和实验验证，揭示了细胞衰老相关基因在近视发病中的核心作用。TP53、CDKN1A和MYC作为关键调控因子，通过影响细胞周期、凋亡过程和免疫细胞浸润参与近视的病理过程。这些发现不仅为理解近视作为衰老相关疾病提供了新视角，也为开发靶向免疫-衰老相互作用的新型治疗策略奠定了基础。