利用电子断层扫描技术对小鼠缺血性脑卒中后血脑屏障进行三维体积分析揭示内皮细胞超微结构重塑

本综述系统介绍了室温电子断层扫描（RT-ET）技术在研究小鼠脑内皮细胞超微结构中的应用，特别是在缺血性脑卒中（ischemic stroke）后血脑屏障（BBB）变化的分析。文章详细阐述了从样本制备（包括化学固定、树脂包埋）到三维重建（3D reconstruction）和分割（segmentation）的全流程方法，克服了传统透射电镜（TEM）二维（2D）成像的局限，为神经血管研究提供了高分辨率、可重现的体积分析工具包，揭示了卒中后内皮细胞中内质网（ER）重塑和转胞吞小泡（transcytotic vesicles）形态改变等新机制。

　　

引言：脑科学研究中的成像挑战与电子断层扫描的机遇

尽管大脑仅占体重的一小部分，但其正常功能依赖于高达四分之一的心输出量。由于高代谢需求和有限的能量储存，大脑需要通过其血管系统持续供应营养。为了有效调节营养运输并保护大脑免受血源性病原体侵害，脑血管必须表达一系列独特特性。脑内皮细胞（ECs）具有独特的特性，称为血脑屏障（BBB）。这一高度限制性结构可维持稳态，并为正常神经元功能提供安全环境。在病理条件下，如脑卒中，BBB完整性受到损害，导致血管通透性和继发性神经元损伤。

虽然BBB破坏已通过传统光学显微镜技术在卒中背景下得到广泛研究，但该领域仍缺乏高分辨率的超微结构见解。电子显微镜（EM）是一种克服这一限制的强大方法；然而，传统方法仅限于获取二维（2D）快照，从而限制了我们对脑微血管复杂三维（3D）结构的理解。电子断层扫描（ET）能够在纳米尺度上进行高分辨率的三维重建。然而，样本制备和ET处理的方法学仍存在知识空白。

光镜与透射电镜的比较

显微镜的基本目的是放大样本图像。光镜（LM）和电镜（EM）的主要区别在于照明源。与使用光子束的LM不同，EM使用投射在样本上方的电子束。分辨率，即可检测两个不同点之间的最小距离，与照明源的波长直接相关。可见光波长约为750 nm，分辨率约为200 nm，而在40 kV加速电压下的电子波长约为0.006 nm，分辨率可达约0.5 nm。由于电子的穿透深度远小于光子，EM样品必须超薄，通常为50至100 nm。透射电子显微镜（TEM）由照明系统、样品室、成像系统、记录系统、真空系统和冷却水循环系统组成。照明系统由电子枪和聚光镜组成，分别产生和聚焦电子束于样品上。聚光镜控制束的强度和直径以进行高倍成像。成像透镜系统包括物镜、中间镜和投影镜。物镜形成第一个倒像并影响最终分辨率。中间镜和投影镜进行进一步放大，最终将图像投射到荧光屏或数码相机上。TEM在真空中运行以防止电子与介质相互作用，从而实现无空气污染的清晰成像。传统的TEM还可以通过添加电动测角仪进行升级。它与样品室集成，允许样品倾斜和旋转，这是电子断层扫描所必需的。

什么是电子断层扫描？

“断层扫描”一词源于古希腊语“tomos graphos”，意为“按切片书写”。断层扫描的目的是通过结合从不同角度获取的物体二维快照来获得物体的三维密度分布。该概念由奥地利数学家Johann Radon于1917年提出；然而，第一次三维断层扫描重建是在1956年天文学中进行的。简而言之，断层扫描包括从不同投影角度捕获物体的二维图像，然后合并这些图像以呈现详细的三维结构。这种方法的应用扩展到生物和医学领域，导致了1968年电子断层扫描（ET）和1973年计算机断层扫描（CT）的发展。两种技术共享相同的概念，区别在于样品和源-探测器装置的相对运动。ET包括样品倾斜和静止的电子束，而CT扫描包括X射线倾斜而患者保持静止。

ET在生物学中的应用为理解精细的亚细胞结构/功能开辟了新视野。例如，ET在线粒体嵴的结构表征中发挥了关键作用。直到2000年代，文献仍使用由Palade提出的挡板嵴模型，其中内膜被表示为具有嵴的连续复杂形态，导致大的褶皱，类似于手风琴的风箱。由于挡板模型基于使用传统TEM的单层二维快照，线粒体嵴的三维体积信息仍不清楚。2000年，Frey等人将ET应用于线粒体，提出了一种新的嵴模型，其中狭窄的管状开口，称为嵴连接，与膜间和细胞间空间相连。ET也极大地扩展了我们对神经元结构和神经传递的理解。特别是，它为轴突末梢突触小泡的组织提供了新见解。Harlow等人将ET应用于青蛙神经肌肉接头，证明活性区材料对于突触小泡停靠和突触通道锚定至关重要。ET方法也被用于研究抑制性突触中突触后密度的组织以及兴奋性突触中谷氨酸受体的排列。

总的来说，ET已成为神经生物学中的常用工具，提高了我们对亚细胞组织的理解。然而，这些研究大多依赖于冷冻（Cryo）-ET技术，这需要快速玻璃化并对样品制备施加了重大限制。确实，Cryo-ET依赖于高度专业化的设备，如 plunge freezer、冷冻传输工作站和支持基础设施，包括持续的液氮供应。这些要求提高了运营成本，限制了能够执行该技术的实验室数量。相比之下，RT-ET使用标准的化学固定和树脂包埋方案进行电子显微镜检查，这些方案广泛可用，需要更少的专业基础设施，并且可以以更低的成本使用，使该方法更易于更广泛的研究机构使用。

为何聚焦于脑内皮细胞？

维持大脑稳态是正常大脑功能的基本前提，并直接依赖于脑血管完整性。因此，脑血管拥有区别于外周血管的独特特性。健康的脑内皮细胞独特在于：（1）限制细胞旁运输的内皮间连接；（2）低速率跨细胞运输（转胞吞作用）；（3）表达高选择性流入/流出转运蛋白；（4）低表达白细胞粘附分子（LAMs）。这些特征为大脑提供了一个不渗透的、选择性的和保护性的屏障，称为BBB。内皮间连接由紧密连接（TJ）和粘附连接（AJ）组成。TJs由一组跨膜蛋白组成，位于内皮细胞的顶表面，建立细胞间接触点，从而限制离子和分子通过细胞旁途径的扩散。TJs由claudins、occludins和连接粘附分子（JAM's）组成。Claudin-5（Cldn-5）是最关键的TJ蛋白。与外周组织相比，中枢神经系统（CNS）由于ECs低表达LAMs，具有低免疫细胞监视。这创造了一个与免疫系统隔离的受保护大脑环境，被称为免疫特权。在病理条件下，包括神经退行性疾病、脑肿瘤、癫痫、炎症和缺血性卒中，细胞旁和跨细胞运输受到不同影响，导致屏障特性丧失。BBB完整性丧失后，血源性病原体和免疫细胞可以渗入脑实质，导致神经毒性。

缺血性卒中约占所有卒中病例的80%，是由脑血管被凝块阻塞引起的，凝块可能源自心脏（栓塞性）或在脑血管中局部形成（血栓性）。阻塞导致脑血流减少，引起能量衰竭并在神经血管单元中引发一系列有害效应。由此产生的病变形成在阻塞血管周围的大脑区域，那里的氧气和葡萄糖供应严重受损。

缺血区域通常根据血流减少程度细分为两个区域。缺血核心经历严重的血流减少，导致快速的ATP耗竭、主动转运蛋白失效、渗透失衡和细胞坏死。这个核心被一个血流中度减少的区域所包围，称为缺血半暗带。尽管最初代谢活跃，但半暗带中的ECs高度易受凋亡影响。这种进行性的内皮变性损害了BBB的完整性，导致血管通透性增加。Knowland等人使用小鼠短暂性大脑中动脉阻塞（t-MCAO）模型进一步提供了BBB破坏时间动态的见解，证明BBB breakdown遵循双相过程。具体来说，早期阶段，发生在t-MCAO后48小时内，主要由ECs中转胞吞作用增加介导，而没有紧密连接的显著损害。相比之下，晚期阶段，t-MCAO后48小时以上，以紧密连接的结构和功能破坏为标志。此外，Nahirney等人使用光血栓卒中模型显示卒中后72小时内BBB破坏，主要由转胞吞作用介导，细胞旁渗漏的证据极少。这表明在某些缺血条件下紧密连接完整性相对保留。然而，这项研究没有包括功能性示踪剂测定，如辣根过氧化物酶（HRP）来直接证明BBB通透性。总之，这强调了高分辨率超微结构和功能分析对于全面表征BBB breakdown的重要性。

获取理解BBB破坏背后的复杂超微结构特征对于理解脑血管可塑性至关重要，脑血管可塑性定义为脑微血管适应和响应刺激和/或损伤的能力。这样的进展需要允许BBB内皮细胞超微结构研究的成像技术。TEM是实现这一目的的强大工具，然而传统的TEM仅限于薄样品的二维单层快照，从而限制了我们对BBB的体积理解。ET克服了这一限制。

高质量的样品制备是在超微结构水平上对脑内皮进行三维重建的关键先决条件。以下部分描述了RT-ET，与冷冻ET相反，因此涉及小鼠脑内皮的化学样品制备。

材料与方法

动物

本研究使用年轻成年雄性B6129SF1/J小鼠（出生后（P）50天P50）（每组n=3：假手术和PT卒中）。所有动物均在室内繁殖，每组笼养不超过五只，自由获取食物和水。所有程序均经渥太华大学动物护理委员会批准，并根据加拿大动物护理委员会的指导方针进行。

光血栓性卒中和辣根过氧化物酶渗漏测定

按照最近描述的方法在B6129SF1/J小鼠中诱导局灶性皮质光血栓性（PT）卒中。简而言之，通过腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物（1 mg/kg）麻醉小鼠，剃去头皮并涂抹消毒液准备颅区。随后，将小鼠置于立体定位框架中。进行中线切口，小心缩回皮肤以暴露感兴趣区域上方的颅骨。通过腹腔注射给予光敏染料玫瑰红（RB；100 mg/kg），使其循环5分钟。然后将530 nm、20 mW激光定位在颅骨上方3 cm处，靶向基于标准立体定位坐标的体感皮层。颅骨保持完整并持续水合以确保对可见光的透明度。激光激活10分钟以启动RB的光活化，导致血小板聚集和血栓形成。假手术小鼠接受相同的外科手术，包括安装在立体定位框架和玫瑰红注射，但省略了激光暴露。卒中后48小时，在PT卒中和假手术小鼠中经眶后逆行注射辣根过氧化物酶（HRP）II型（10 mg/20 g体重，溶于PBS）。HRP循环30分钟后，处死小鼠，取出大脑并浸入固定剂中固定（见下文）。然后制备游离漂浮冠状切片（50 μm）。为了显示HRP，将切片在含有3,3'-二氨基联苯胺（DAB）和0.01%过氧化氢的0.1 M PB中孵育20分钟。随后将切片在四氧化锇中进行后固定，脱水并包埋在环氧树脂中，如下所述。

室温电子断层扫描的样品制备

为了保存超微结构并保持对比度，样品应经过关键且高度严格的制备过程。组织必须通过化学固定尽可能接近其天然状态保存。该过程包括多个步骤，任何错误最终都会影响成像质量。

样品固定

此初始步骤的目的是停止所有代谢过程和酶促反应，以防止组织自溶。固定可稳定细胞组织和膜，防止细胞损伤和随之而来的形态学改变。ET的固定有两种常用方法：物理法和化学法。物理法通常涉及冷冻固定。化学法是更常用的方法，涉及固定化学品。

对于室温ET，固定剂的选择基于样品的性质以及研究类型。因此，没有适用于特定样品的通用固定剂。然而，最广泛使用的是多聚甲醛（PFA）和戊二醛。它们有助于形成蛋白质凝胶，从而导致不同蛋白质之间形成交联（通过游离氨基酸基团）。这些固定剂具有不同的特性。PFA的穿透能力及其停止酶活性的能力比戊二醛更强。然而，PFA形成的交联不太稳定，因为该过程是可逆的。戊二醛是一种穿透能力慢的固定剂，但它与蛋白质形成稳定的共价交联，能更好地保存细胞超微结构。这些交联还增加了样品的电子密度，从而增强了电子散射并改善了图像对比度。考虑到两种固定剂的特性，含有戊二醛和PFA的混合物可产生最佳固定效果。根据已发表的方案，我们发现全身固定最适合成熟小鼠（>P30），因为经心脏灌注面临的挑战较少。首先，需要用50 mL冰冷50 mM磷酸盐缓冲盐水（PBS）进行经心脏灌注，以清除血管腔中的血浆和红细胞。PBS灌注之后是225 mL固定液，其中含有4% PFA和2%戊二醛，稀释于0.1 M磷酸盐缓冲液（PB）中。所选戊二醛浓度可以从2%到3%不等；然而，戊二醛已知会引起组织收缩，影响超微结构。我们已确定2%戊二醛是研究脑内皮细胞的最佳浓度，具有最佳结构保存和对比度比率。为了完成结构保存以及交联，取出的固定大脑应在4°C下在0.1 M PB中的4% PFA溶液中孵育30分钟，然后在振动切片机切片前进行两次PBS清洗（第3.2节）。

请注意，为了去除任何杂质，在开始动物灌注之前过滤固定液至关重要。更重要的是，为了防止灌注压力造成内皮损伤，灌注流速不应超过5 mL/min。

室温ET的化学固定也可以通过浸渍而不进行灌注来完成，这推荐用于经心脏灌注更具挑战性的幼年动物（

尽管戊二醛和PFA与蛋白质具有高反应性，但两者对脂质的选择性有限。因此，ET样品制备的下一阶段涉及后固定以增强膜对比度。但首先，为了增强固定剂的渗透，组织应在后固定前用振动切片机切成薄片（50 μm）。

振动切片机切片

固定的大脑应使用振动切片机（例如，Leica VT1000S）自由漂浮地冠状切成连续的50 μm厚切片。为了获得脑切片的最佳振动切片机参数，我们将频率和速度分别设置为模式“10”和“3”。50 μm脑切片可以长期存储在抗冻溶液（30%甘油，30%乙二醇，40% PBS）中于-20°C，或立即用于处理（后固定，第3.3节）。为了超微结构的最佳保存，强烈建议在样品固定最后一步（第3.1节）的同一天进行振动切片机切片。

后固定

四氧化锇（OsO₄）通常用作次级固定剂，它与脂质相互作用而不改变细胞质和线粒体形态。鉴于其对蛋白质的破坏性特性，OsO₄不能用作初级固定剂。

基于现有报告，我们选择锇-四羧基酰肼-锇方法（OTO）作为ET的最佳方法，因为它最大限度地减少了伪影形成，并且不需要额外的对比度增强。该方法涉及使用四羧基酰肼（TCH）作为两次锇处理之间的桥梁进行双重染色。基本原理是使用OsO₄，一种电子致密的重金属，优先与不饱和脂质相互作用，从而稳定和增强膜结构的对比度，同时进一步保存超微结构细节。对于OTO方法，描述如下，样品首先用OsO₄和亚铁氰化钾（K₄Fe(CN)₆）的混合物处理。由Morris Karnovsky开发，OsO₄和K₄Fe(CN)₆之间的反应导致还原的OsO₂，从而通过与脂质相互作用防止沉淀的形成。第二次用OsO₄处理包括使用TCH作为OsO₂和OsO₄之间的桥梁结合更多锇来进行对比度增强。

首先，将储存的组织切片从抗冻溶液中取出，并在1 M PBS中洗涤5次，每次3分钟。在洗涤过程中，制备两种溶液。第一种溶液包括将3% K₄Fe(CN)₆稀释在0.1 M PB中的溶液与等体积的4%水性OsO₄混合以获得还原的二氧化锇OsO₂。然后将组织切片在该混合物中在室温下避光（例如，用铝箔覆盖）孵育1小时。第二种溶液含有0.1 g TCH溶解在10 mL Milli-Q水中，并在60°C的烤箱中孵育1小时（同时样品在铁氰化钾-锇溶液中孵育）。重要的是，为了TCH粉末在Milli-Q水中的均匀溶解，建议每10分钟轻轻摇动 warming TCH溶液一次。烤箱孵育结束后，在使用前通过0.22 μm Millipore注射器过滤器过滤均匀的TCH溶液。在还原的二氧化锇OsO₂溶液中孵育后，样品在Milli-Q水中洗涤5次，每次3分钟。洗涤后，组织切片在过滤的TCH溶液中在室温下避光孵育20分钟。在TCH溶液中孵育结束后，进行五次Milli-Q水洗涤（每次3分钟），然后进行下一步。此后，样品在含有2% OsO₄稀释于Milli-Q水中的溶液（即第二次暴露于锇）中在室温下避光孵育30分钟。后固定的最后一步包括在2% OsO₄中孵育后再次在Milli-Q水中进行一系列洗涤（5次，每次3分钟）。固定后，样品脱水。

脱水

所有生物样品都含有水，这带来两个主要挑战。第一个挑战是难以产生超薄切片。第二个挑战是将含水样品装入电子显微镜的高真空柱（~10^?5 Pa）中的不兼容性。由于这些原因，样品中的水应首先被有机溶剂取代。该步骤通过将组织切片在冰冷乙醇的梯度系列中孵育来完成，顺序如下：30%–50%–70%–80%–90%–100%–100%–100%。每次处理必须持续2分钟。最后一步包括通过用环氧丙烷（Sigma）替换最后一次（第三次）100%（无水）乙醇溶液来完全去除水，将样品孵育5分钟。重要的是，环氧丙烷是一种塑料溶剂；因此，在收集环氧丙烷时，必须将组织切片转移到玻璃小瓶（例如，EMS）中并使用Hamilton玻璃注射器。用环氧丙烷溶液替换无水乙醇也是最佳树脂包埋的先决条件，因为环氧丙烷也用作树脂溶剂。

样品的树脂包埋

将样品包埋在树脂中硬化以便于超薄切片。它包括用树脂单体替换环氧丙烷，该单体一旦聚合，就会产生嵌入组织的固体块。这有助于实现最佳切片特性，且组织压缩最小。此外，树脂包埋确保了样品在电子束下的稳定性，从而防止样品损伤。

对于此步骤，按以下顺序制备四种Durcupan树脂组分（EMS）的混合物：20 g组分A，20 g组分B，0.6 g组分C和0.4 g组分C。缓慢而轻柔地混合混合物而不产生气泡，然后转移到铝皿（Fisher）中。在脱水步骤结束时（即环氧丙烷孵育后），将组织切片转移到含有制备好的树脂的铝皿中，沉入树脂中，并在室温下孵育过夜。过夜孵育后，将样品在55°C下加热5分钟（以液化树脂），放置在两层Aclar片（EMS）之间，嵌入一层液态树脂中，并转移到55°C的烤箱中72小时进行树脂聚合。

超薄切片

由于电子束的穿透有限，EM图像的分辨率高度依赖于切片的厚度。切片越厚，对比度越低。超薄切片机是用于执行超切片的工具。在超薄切片之前，从树脂包埋的脑切片中分离出皮层区域，并使用手术刀彻底切成2 mm²的小块。随后，使用氰基丙烯酸酯粘合剂（Gorilla超强胶水）将这些小块安装在树脂块上。

对于RT-ET specifically，使用超薄切片机（例如，Leica UC6）收集140 nm厚的超薄切片带在100目铜网上。

总的来说，上述每个步骤对于获得高对比度、高分辨率和较少伪影的样品至关重要。样品制备过程中引起的任何错误都会影响样品的质量，进而影响断层图的质量。

RT-ET：断层图生成、分割和3D渲染

ET工作流程包括以下关键步骤：（1）通过倾斜样品获取数据；（2）对齐获取的2D图像并分配X/Y/Z旋转角度（也称为欧拉角）；（3）计算3D重建和可视化；（4）断层图的分割和解释。

倾斜数据采集——基本原理

倾斜数据采集包括使用测角仪通过围绕倾斜轴旋转样品从不同角度记录2D图像。理解采集参数，如加速电压、电子剂量和倾斜设置，将直接影响断层图质量并影响后续分割。加速电压影响分辨率和对比度。较高电压通过增加电子穿透样品和减少散射来提高分辨率，但会降低对比度。较厚的样品需要较高的加速电压来收集高分辨率数据。电子剂量是另一个需要考虑的参数，指的是成像过程中样品暴露的电子量。较高剂量改善对比度和分辨率，但可能通过产生热量导致样品破坏。倾斜角度范围定义了样品在采集过程中倾斜的程度。通常，此参数不超过±60°旋转；但特殊情况下可扩展至±80°。更宽的倾斜角度范围提高了3D重建的准确性，但这意味着样品暴露于电子束的时间更长，可能会损坏样品。此外，更宽的倾斜角度范围增加了倾斜时电子束的投影厚度。例如，对于70 nm厚的样品，在60°时投影厚度将代表约140 nm。此外，样品杆阴影和样品室内的受限空间阻止了完整的±90°旋转，从而使几个样品区域无法被电子访问。这种现象被称为“缺失楔效应”，导致诸如结构伸长和扭曲等伪影。它通常在执行单轴倾斜时发生。该方法涉及样品仅围绕一个轴倾斜，通常用于较短的数据采集时间以及较少的调整和处理。相反，双轴倾斜涉及样品围绕两个垂直轴倾斜。该方法最小化了“缺失楔效应”，但需要更多时间进行数据采集，以及更多的调整和倾斜数据处理来生成断层图。除了倾斜范围之外，角度增量，以倾斜角度之间的步长为特征，是开始采集数据之前要设置的另一个重要参数。较小的增量角（通常为1°–2°）提供更精细的细节，减少伪影并提高分辨率。倾斜角度范围和增量都影响断层图质量，然而，收集数据的顺序，称为倾斜方案，是另一个需要考虑的参数。有三种不同的倾斜方案：连续、双向或剂量对称。连续倾斜方案包括从一个角度到相反角度的单向采集。这种方法效果较差，因为在到达0°（投影厚度最优化）之前样品累积损伤增加。双向倾斜方案包括从0°开始数据采集，向一个极端角度进行，然后返回0°，再继续向相反的极端角度进行。该方法在最小投影厚度下以低电子剂量保存数据质量，确保更好的分辨率。然而，该方案导致电子剂量分布不均匀，影响后半部分倾斜数据的质量。相反，剂量对称倾斜方案涉及样品遵循钟摆式运动直到极端角度。该方法确保均匀的电子剂量采集并增强整体数据质量。然而，它需要更长的样品台稳定时间 after each tilt step，导致样品台漂移或样品不稳定。这可能导致感兴趣区域漂移或错位，特别是在更高放大倍数或对束敏感样品的情况下。总之，在开始倾斜系列采集之前应始终考虑这些参数，因为它们将影响后续的3D重建和分割步骤。

倾斜数据采集——协议

此处，我们提供了使用David Mastronarde开发的SerialEM软件对小鼠脑内皮进行ET的协议。在开始倾斜系列采集之前，重要的是确保超薄切片完好并覆盖载网，没有褶皱或断裂。此外，脑微血管应形态保存完好，焦平面优化，束居中以保持对比度和分辨率。一旦超薄切片和微血管完整性得到验证，应验证角度倾斜范围以确保视场不会接近载网边缘，因为这可能 obstruct 倾斜轴并 prematurely 终止倾斜系列采集。SerialEM具有倾斜控制面板，允许在角度倾斜范围内精确导航到所需角度。用户应通过单击“To”并设置+60°导航到极端角度。单击“OK”后，测角仪将旋转到所选角度。此过程应对两个极端角度（±60°）执行。在±55°处可见的边缘是可以接受的，并且可以在3D重建期间裁剪（如下所述）。在我们的示例中，倾斜数据采集在x25000下进行；但是，放大倍数应根据样品形态特异性进行调整。在开始倾斜系列之前，重要的是设置共心高度以在整个倾斜过程中保持感兴趣区域居中并对焦。通过导航到菜单栏并按“tasks → eucentricity → rough eucentricity”来校准粗略共心性。校准粗略共心性后，应通过选择“eucentricity → refine and realign”进行精细校准。

一旦设置了最佳共心高度，可以通过选择“tilt series → setup/start”命令开始倾斜系列采集。将出现一个显示倾斜参数的新窗口。通过选择“GO”命令，软件将提示指定包含从现在起获取的倾斜数据的文件的名称和目录，并保存为.st文件。在开始倾斜过程之前，将出现一个新窗口并提供选择文件属性。用户应检查以下参数：“MRC stack file,” “Unsigned integers,” “Tilt data,” “Intensity,” “Stage position,” “Magnification” and “Exposure dose.” 将“Maximum number of sections”参数分配为“360”，并选择“Save extra information in a ‘.mdoc’ metadata file”，然后按“OK”开始倾斜系列。采集过程将通过低放大倍数（x6000）导航到感兴趣区域开始。之后，放大倍数将增加到用户设置的水平，从而使感兴趣区域离轴。此过程确保束传输到样品的大面积上，减少热损伤。然后束在调焦时被“blanked”，在设置散焦后，获取快照。此过程在每个倾斜角度自动重复，直到完成倾斜系列采集。获取后，这些投影通过各种反投影算法进行对齐和重建。

倾斜数据对齐——基本原理

倾斜数据采集后，获取的原始图像堆栈包含潜在的伪影，例如沿X/Y/Z轴的图像偏移或由自动采集引起的放大倍数变化。这些伪影可以通过对齐步骤进行校正，该步骤可以使用不同的方法执行。基准标记方法涉及向样品添加金纳米颗粒并跟踪它们在图像堆栈中的位置以根据倾斜轴确定感兴趣对象的几何参数。然而，尽管对齐精确，但电子致密的金纳米颗粒会产生可能掩盖生物超微结构的伪影。或者，无基准方法通过交叉关联样品的共同 motif 来对齐原始数据，通常使用0°投影作为参考，然后进行迭代区域匹配和坐标校正。该方法确保高度准确的自动对齐，并最大限度地减少手动干预和伪影。因此，高质量的样品制备对于识别共同 motif 和提高对齐准确性至关重要。

倾斜数据对齐——