油菜Rlm3基因作为抗真菌病原体广谱抗性基因的分子研究：靶向结构保守效应子的探索

本研究深入探讨了油菜Rlm3基因对多种真菌病原体（如Leptosphaeria maculans和Fulvia fulva）所分泌的结构保守效应子（如AvrLm3和Ecp11-1）的识别机制。通过分子实验和结构分析，揭示了关键氨基酸位点（如G131和F134）在效应子识别与逃逸中的核心作用，并证实了AvrLm4-7的抑制效应。该研究为开发广谱抗病（ETI）基因和可持续作物保护策略提供了重要理论基础。

　　

1 引言

植物抗病（R）基因通过识别病原体效应子（avirulence, AVR）触发免疫反应（effector-triggered immunity, ETI），是实现作物病害控制的有效手段。然而，单一R基因的大规模部署常导致病原体快速进化，通过AVR基因缺失、突变或表达抑制等方式逃逸识别，从而引发抗性丧失。近年来研究发现，效应子蛋白存在有限的结构家族，这为开发能够识别同一结构家族多个成员的广谱R基因提供了新思路。

在Leptosphaeria maculans（油菜黑胫病菌）与油菜（Brassica napus）的互作系统中，已克隆13个AVR基因，其中4个编码属于LARS（Leptosphaeria AviRulence and Suppressing）结构家族的效应子。AvrLm3作为LARS家族成员，其同源蛋白存在于其他真菌物种（如Fulvia fulva的Ecp11-1）。前期研究表明，Ecp11-1可被携带Rlm3基因的油菜品种识别，且该识别作用在AvrLm4-7存在时被抑制。本研究进一步拓展了Rlm3的抗性谱，评估其对Fusarium oxysporum和Zymoseptoria ardabiliae效应子的识别能力，并深入分析了AvrLm3和Ecp11-1中被Rlm3识别的关键蛋白区域和氨基酸位点。

2 材料与方法

2.1 菌株与植物培养条件

实验使用L. maculans分离株Nz-T4（对Rlm3、Rlm4和Rlm7均无毒力）作为遗传转化受体。真菌培养于V8培养基，25°C黑暗条件下培养7天，随后在紫外光混合光照下产孢10–14天。油菜植株在光周期16小时（22°C）/8小时（18°C）条件下生长。

2.2 真菌转化

通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的转化将目标基因导入L. maculans，转化子通过诺尔丝菌素（nourseothricin）或潮霉素（hygromycin）筛选纯化。

2.3 油菜接种试验

采用子叶接种法，使用孢子悬浮液（10⁷个/mL）接种携带不同R基因（Rlm3、Rlm4、Rlm7）的油菜品种，接种后12–21天按1（抗病）至6（感病）级评分标准记录症状。

2.4 质粒构建与DNA操作

目标基因（AvrLm3、ECP11-1及其突变体）经合成后克隆至pTwist_amp载体，再通过Gibson组装插入pPZPnat1-promAvrLm4-7载体，用于真菌转化。

2.5 RNA提取与qPCR分析

使用TRIzol试剂提取油菜接种部位的RNA，反转录后通过SYBR Green法进行定量PCR（qPCR），分析基因表达水平。

2.6 高分辨率熔解曲线分析

通过高分辨率熔解（HRM）技术检测转化子中AvrLm3突变体的表达情况，使用Bio-Rad CFX96系统进行熔解曲线分析。

2.7 生物信息学与结构预测

通过PSI-BLAST和tBLASTn搜索NCBI及JGI数据库，鉴定AvrLm3同源蛋白。使用AlphaFold3预测蛋白三维结构，并通过PyMOL和Chimera进行结构分析。

3 结果

3.1 AvrLm3中两个氨基酸突变足以逃逸Rlm3识别

对238个L. maculans分离株的AvrLm3基因分析发现28个多态性核苷酸，对应17个等位基因和22个非同义突变。其中I/L⁵⁸H、G¹³¹R和F¹³⁴Y突变与毒力表型相关。点定向突变实验表明，双突变G¹³¹R/F¹³⁴Y或三突变I58H/G131R/F134Y可使AvrLm3逃逸Rlm3识别，而单突变或I58H/G131R双突变则不能。HRM分析证实突变体在植物体内正常表达。

3.2 Ecp11-1中三个氨基酸突变是逃逸Rlm3识别的必要条件

Ecp11-1与AvrLm3具有37%的氨基酸一致性。突变实验显示，双突变G132R/W135Y不能逃逸识别，而三突变Q59H/G132R/W135Y则成功逃逸，表明Q59位点在Ecp11-1识别中起关键作用。

3.3 AvrLm3和Ecp11-1在其他植物病原真菌中的同源物

通过生物信息学分析，在Fusarium oxysporum f. sp. narcissi、F. oxysporum f. sp. cepae和Zymoseptoria ardabiliae中鉴定到4个AvrLm3/Ecp11-1同源蛋白。这些蛋白均具有10个保守半胱氨酸和信号肽，三维结构预测显示它们均具有LARS家族特征性折叠。

3.4 Rlm3介导的抗性由AvrLm3同源物触发

将同源基因导入L. maculans后，发现Fusarium_oxysporum_narcissi_BFJ63_g18418能够触发Rlm3介导的抗性，而其他同源物则不能。RT-qPCR证实所有转化子均正常表达目标基因。

3.5 AvrLm4-7对Rlm3介导抗性的抑制

实验证实AvrLm4-7的存在可抑制Fusarium_oxysporum_narcissi_BFJ63_g18418触发的Rlm3抗性，与前期对AvrLm3和Ecp11-1的观察一致。

4 讨论

本研究证实Rlm3能够识别来自不同真菌物种的LARS家族效应子，包括AvrLm3、Ecp11-1和Fusarium_oxysporum_narcissi_BFJ63_g18418。关键氨基酸位点（如AvrLm3的G¹³¹和F¹³⁴）的突变可导致识别逃逸，而AvrLm4-7则通过表观抑制机制阻断识别。这些发现表明Rlm3具有广谱抗性潜力，其靶向的效应子在多种病原真菌中高度保守。通过结构功能分析和进化比较，为设计可持续的抗病策略和工程化广谱R蛋白提供了分子基础。未来研究可进一步探索Rlm3在同源宿主植物中的转移应用，以及其在微生物组互作中的生态意义。