金属配位特异性与结构动态：基于秀丽隐杆线虫金属硫蛋白I（MTL-1）的三维建模与分子动力学模拟研究

本研究通过AlphaFold建模与分子动力学（MD）模拟，系统揭示了秀丽隐杆线虫金属硫蛋白I（MTL-1）在无金属（Apo）及与Zn2+、Cd2+、Cu2+、Hg2+和Pb2+结合状态下的构象动态与稳定性差异，为理解金属硫蛋白（MTs）的金属选择性、结构柔性及环境应答机制提供了原子层面洞察。

　　

3.1 基于Foldseek检索的AlphaFold模型呈现中等质量，但其灵活性提供重要见解

对小分子且高柔性蛋白质进行建模始终面临挑战，主要源于其有限的结构信息和高度的构象可塑性。近年来，基于深度学习的算法如AlphaFold为这一领域带来了突破。本研究直接通过Foldseek平台从AlphaFold蛋白质结构数据库（AFDB）中检索得到秀丽隐杆线虫金属硫蛋白I（MTL-1）的三维模型（登录号：P17511 AF-P17511-F1-v4）。该模型基于折叠层面相似性而非单纯的序列同源性进行筛选，这对于像金属硫蛋白这类小而富含半胱氨酸、且在本动物类群中已知结构同源物极少的固有无序蛋白（IDP）尤为有利。

该模型覆盖了全长蛋白序列（1-75位残基），弥补了实验数据的不足（目前仅有一个部分的NMR结构，PDB:8AQ9）。其几何参数评估显示质量为中等，MolProbity得分为2.35（通常小于2.0代表高分辨率晶体结构，小于3.0则认为预测模型合理），GMQE（全球模型质量估计）得分为0.60，也反映了中等程度的预期准确性。Ramachandran图分析显示约98.5%的残基位于允许区域内，仅1.5%位于不允许区域，表明其立体化学质量良好。ERRAT验证得分为91%，表明非键原子-原子相互作用错误率低。ProSA分析得到的Z-score为7.23，与同等大小蛋白质一致。QMEAN得分为-3.43，提示存在结构模式偏差，尤其是在低置信度预测区域。模型平均pLDDT（预测局部距离差异测试）得分约为60，根据AlphaFold标准属于中等置信度。AlphaFold系统性地为金属硫蛋白这类富含柔性金属结合环的内在无序区域分配较低的pLDDT值。

尽管QMEAN负值较高且pLDDT值中等表明模型存在结构偏差和低置信度区域，但已认识到这些低置信度片段可能包含有关条件性有序的重要信息，即蛋白质的最终构象并非极度稳定，而是处于稳定性的边缘。这意味着其折叠状态很容易因环境条件（如pH值）或氨基酸序列的微小改变而发生变化。这种行为与内在无序蛋白（IDPs）的特性一致。因此，在此背景下，当实验蛋白质解析数据（如X射线晶体学或核磁共振NMR）缺失或难以获得时，AlphaFold的预测（包括对无序蛋白的结构注释）可以成为宝贵的资源。

3.2 金属配位增强柔性MTL-1的构象稳定性

本研究以MTL-1的Apo形式（无金属状态）作为参考结构。尽管模拟时未加入金属离子，但此Apo状态被制备成具有配位能力的构象，所有半胱氨酸（Cys）残基以去质子化的硫醇盐形式（S^?），组氨酸（His）残基以中性形式存在，以反映其潜在金属相互作用的功能预组织状态。这种质子化方案确保了Apo和Holo（金属结合）系统之间的可重复性，并保持了适合潜在金属配位的构象。

正如预期，有金属和无金属的MTL系统都表现出较高的柔性（较高的RMSD值），其中Apo形式的RMSD最高（17.77 ± 1.08 ?），反映了其扩展且灵活的特性，与其内在无序蛋白（IDP）的性质一致。MTL-1 Apo呈现扩展结构，其约86%的构象由转角、弯曲和无规卷曲组成，这必然导致其分子动力学参数（RMSD, RMSF, SASA, R_g）值最高。

相反，对金属配位系统的分析表明，Cd²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺和Hg²⁺的配位稳定了MTL-1，表现为比MTL-1 Apo更低的RMSD值。此处的“稳定性”指的是模拟中观察到的结构紧缩和灵活性降低。最终50 ns的RMSD值分析显示金属类型对结构偏差有高度显著的影响。事后Tukey检验表明Cu²⁺和Cd²⁺之间无显著差异，表明这些金属诱导了类似的结构紧缩作用。Cu²⁺和Cd²⁺均与Zn²⁺和Hg²⁺存在显著差异，后者彼此间也有差异。Pb²⁺表现出最高的RMSD（11.04 ± 0.60 ?），且与所有其他金属存在显著差异。

RMSF数据显示，Cd²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺和Hg²⁺的金属配位诱导了残基柔性变化的相似模式，仅在波动强度上略有区别（Pb²⁺除外）。这意味着蛋白质最灵活和最刚性的区域保持一致，与金属配位类型无关，表明该蛋白质在金属暴露下具有结构化的全局功能。最显著的变化出现在靠近N端的区域，特别是Asp16、Lys17、Gly21和Asp22等残基附近。

对Apo形式的分析揭示了更高的波动性，尤其是在金属配位区域。虽然整体更具动态性，但这些波动遵循非随机的、局部化的模式，表明参与配位的结构元件是部分预组织的。这可能促进了与Cd²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺和Hg²⁺配位后观察到的快速稳定。Pb²⁺带来的灵活性降低有限，进一步强调了金属特异性兼容的重要性。

此外，考虑到秀丽隐杆线虫MTL-1的折叠，生物物理研究提出了一个两结构域模型：结构域1（残基1-26）和结构域2（残基27-75）。本研究结果显示，结构域1具有更高的灵活性，RMSF峰值和绝对值均高于结构域2，这与哺乳动物金属硫蛋白异构体已确立的结构特征相一致，表明蛋白质三维行为的稳定性可能在不同物种间是保守的。

这些指标（RMSD、RMSF、回转半径和SASA）之间的一致性相互依赖关系证明了金属配位对MTL-1结构产生的整体稳定效应。SASA的变化范围（Cd²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺和Hg²⁺系统在5000至6000 ?2之间）以及回转半径的最小变化（约0.3 ?）表明，金属硫蛋白的整体构象在不同金属间保持相似，微小差异可能与配位残基的特异性相互作用或每种金属的特性有关。

3.3 不同金属离子在MTL-1配位中的变异性和影响

推定的配位位点是根据金属离子与氨基酸之间稳定的接近程度推断的。它们之间的距离对于Cu²⁺小于2.0 ?，对于Zn²⁺、Cd²⁺和Hg²⁺小于2.5 ?，对于Pb²⁺小于3.0 ?。距离低于3.0 ?表明存在强配位键。正如预测，半胱氨酸（Cys）是参与这些相互作用最频繁的氨基酸，与金属离子形成稳定复合物。当替换Zn²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺或Hg²⁺时，配位位点结构基本保持不变，但Pb²⁺除外。诸如Cys12、Cys26、Cys31、Cys40和Cys55等残基经常参与与测试金属的配位，表明它们对MTL-1的结构至关重要，是有效金属螯合所必需的。

在本研究中，所有金属复合物在整个模拟过程中都表现出一定程度的簇集或紧缩，这是簇状结构的特征。与此同时，Pb²⁺呈现出更中间的分布，更符合珠串状结构。实验条件下，紧凑排列涉及桥连硫醇盐，即半胱氨酸中的硫在两个金属离子之间形成“桥”，与两者配位从而将它们连接起来，本研究中有Cys12、Cys39、Cys40和Cys55等残基参与，尤其是在Zn²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺和Hg²⁺金属的配位中。这种簇集组织是人类MTLs提出的协同金属化途径的一个关键特征，其中金属化被促进以推动蛋白质结构化。另一方面，非协同性发生在一个金属化事件不促进后续金属化事件时。虽然本研究仅测试了完全金属化状态，未评估离子添加的影响，但观察到Pb²⁺金属组不能很好地适应金属硫蛋白的配位环境，并且不遵循其他金属的典型协同模式。Pb²⁺的非协同行为可能导致MTL结构更加无序或灵活，离子位置和蛋白质构象存在显著变化，这体现在模拟中RMSD和回转半径的更大变异上，表明结构稳定性较低。

金属硫蛋白的全局稳定性受多种因素影响，包括物理化学条件，但金属特性尤为重要。通常，二价金属离子对特定配体（或一组配体）的亲和力与金属的第二电离焓相关，遵循Irving-Williams系列，该系列对二价金属离子形成的复合物的相对稳定性排序为：Mg²⁺ < Mn²⁺ < Fe²⁺ < Co²⁺ < Ni²⁺ < Cu²⁺ > Zn²⁺。在本研究中，系统总体收敛后，就RMSD值参数而言，Cu²⁺诱导的MTL-1稳定性最高，其次是Zn²⁺、Hg²⁺和Cd²⁺，差异细微。另一方面，Pb²⁺离子导致最低的MTL稳定性，产生更高的RMSD值。

在实验条件下，Pb²⁺与MTL的配位以高度可变性和复杂性为特征，一些复合物变得更稳定，而另一些可能解离并且在pH变化时高度敏感。这可以部分解释该金属在模拟中构象变化的多样性。在不同模拟运行中，观察到某些Pb²⁺金属的配位位点存在偏差。具体来说，离子4和离子7持续缺乏与蛋白质的配位——离子4在所有重复中如此，离子7在重复3中如此。此外，离子3和离子5在重复2和3中与残基的配位相对较弱且不一致。这种缺乏或弱配位在其他任何测试金属中均未观察到。与其他金属（如锌或镉）相比，Pb²⁺对MTL的亲和力相对较弱。这主要是由于所涉及的相互作用的性质。研究表明，Pb²⁺与MTL的结合较不稳定，导致在生理条件下更高的解离可能性。此外，Cys残基仍然是Pb与MTL-1的主要配位位点，其中观察到缺乏桥连半胱氨酸硫，这一特征先前曾与兔肝Pb₇-MT2(II)的灵活性增加相关。

此外，虽然在我们的模拟中，MTL系统中所有半胱氨酸的去质子化可能有利于Pb²⁺离子对去质子化硫醇盐配体的亲和力，潜在地增加了复合物的稳定性，但它也可能促进静电相互作用和蛋白质配位几何形状的变化。最后，Pb²⁺与MT的配位可能具有时间依赖性行为，由于该金属独特的配位特性，可能会随时间变化。这可能会影响金属硫蛋白复合物的稳定性和构象，导致在分子动力学模拟过程中配位位点占据和整体蛋白质结构的潜在变化。

3.4 MTL-1中的金属相互作用：半胱氨酸及其他

半胱氨酸（Cys）残基允许与金属形成高亲和力复合物，形成“锚定点”，这可能对蛋白质功能至关重要。然而，与金属配位的多功能性可能是IDP功能的一个关键方面。金属硫蛋白上的配位位点可能是高度动态的，并且能够快速适应不同的金属，这对于该蛋白质在可变条件响应中的调节和功能至关重要。MTL序列中半胱氨酸数量的增加也与半胱氨酸侧翼序列内无序倾向的增加相关，这潜在地增加了在还原条件下（如我们的模拟条件）的构象可塑性。

在此背景下，除半胱氨酸外，其他残基可能在金属配位中扮演关键角色。在本研究中，谷氨酸（Glu）残基对于与Cd和Hg离子以及Cys的配位尤为重要。此外，Glu还参与了一个Cu离子的配位。赖氨酸（Lys）、酪氨酸（Tyr）和脯氨酸（Pro）也作为键稳定残基出现，其中Lys参与了Pb的配位。这些非Cys残基在整个模拟过程中保持小于2.5 ?的距离，表明金属与MTL-1中氨基酸残基之间存在强配位相互作用。

关于非Cys残基观察到的多样化配位作用，注意到组氨酸（His）残基，尽管以中性形式（HIE）建模，并未在任何模拟系统中参与稳定的金属配位。这表明对于MTL-1和所研究的金属，组氨酸侧链的空间排列以及金属对半胱氨酸硫醇盐的更强偏好超过了它们在这些条件下的潜在配位能力。

实验和建模研究一直提供证据表明，其他残基如Glu、Lys、Ser和Asp可以与半胱氨酸一起参与金属配位，影响复合物的结构和稳定性的调节。非Cys残基与金属的特异性配位可归因于多种因素的综合作用，例如特定的静电相互作用或局部构象。例如，Glu残基具有羧酸根基团（COO^?），它可以与金属相互作用使键更稳定，即使它不是化学亲和性的首选。位于第19和32位、每个都被两个附近Cys残基侧翼的Glu残基可能改变了金属离子的亲和力，特别是对于具有高极化率的Hg²⁺（意味着其电子云很容易被外部电场扭曲）。MTL-1中非Cys残基的存在与Cys的存在同样关键，因为这些非Cys残基可以影响哪些金属被优先配位以及它们被螯合的有效性。此外，其他解释因素，如相互作用位点空腔的大小和几何形状，也是有助于理解金属离子选择性的重要方面。

如前所述，观察到Pb²⁺在测试金属中诱导的稳定性最低，在不同残基上表现出多样的相互作用模式。实验研究提供了间接证据，表明Pb²⁺在富含硫醇的环境（如谷胱甘肽和锌指）中的配位与Pb²⁺偏好与硫原子强配位是一致的，这些硫原子是模拟金属硫蛋白中观察到的相互作用的功能类似物。确实，Pb²⁺与一些半胱氨酸残基强配位。另一方面，Pb²⁺的配位化学，加上蛋白质的扩展构象和动力学，似乎有利于与非Cys残基发生瞬时相互作用的条件。实际上，对铅与金属硫蛋白配位的研究表明，金属化过程随不同实验条件而变化。此外，尽管MTL在Pb²⁺的配位和解毒中发挥作用，但其在此功能中的能力和效率对铅的反应性低于对其他金属（如Zn和Cd）的反应性。这些特征，例如相关变化的高速率或特定配位位点的中等亲和力，在IDP相互作用中很常见。这些相互作用可能是构象选择和诱导契合机制的结合，依赖于现有的结构元件和结合后的结构变化。

4 结论

本研究利用分子动力学模拟和基于AlphaFold的建模，为理解秀丽隐杆线虫金属硫蛋白I（MTL-1）的结构灵活性及金属配位特性提供了有价值的见解。尽管由于MTL-1的内在无序特性，部分结构预测置信度仅为中等，但模拟揭示金属配位显著稳定了蛋白质结构，其中Zn²⁺（就R_g而言）和Cu²⁺（就RMSD而言）诱导了最高程度的紧缩和稳定性。例外是Pb²⁺，它表现出较弱的稳定作用，表明其配位是非协同性的，且蛋白质结构灵活性更大。尽管本研究方法提供了有用的结构见解，但并未完全捕捉金属结合的热力学或量子力学方面，这可在未来研究中解决。此处观察到的非半胱氨酸残基在金属配位中的作用，强调了金属硫蛋白功能的复杂调控机制超出了经典的半胱氨酸-金属相互作用。这些发现不仅证实了先前关于MTL稳定性依赖于金属配位的实验观察，还为理解金属硫蛋白响应不同金属的结构动力学提供了新的见解。