抗菌茶树精油微载体的创新设计与缓释性能：基于海藻酸钙包封技术的优化及其在伤口治疗中的应用潜力

本综述系统优化了茶树精油（TTO）海藻酸钙微载体的乳化-交联制备工艺，重点探讨了海藻酸钠（SA）浓度、收集距离和硬化时间对微载体结构及功能的影响。研究结果表明，在1% SA、2 cm收集距离和30分钟硬化时间条件下制备的微载体具备高包封率（85%）、高载药量（31%）和优异的长期稳定性（12个月保留75.7% TTO）。该微载体展现出显著的pH响应释放行为与对大肠杆菌DH5α的高效抗菌活性（抑制率89.5%），为天然抗菌剂在创面愈合中的可持续释放系统提供了有力支持。

　　

1. 引言

近年来，微载体作为药物递送系统因其能够提高药物生物利用度和释放稳定性而受到广泛关注。这些微型容器具有聚合物外壳，能够包封固体粉末和液体材料，在控制药物释放中发挥关键作用。微载体的尺寸通常在1至1000 μm之间，其形状和结构取决于封装方法和材料类型。天然聚合物因其低成本、低毒性、易获得和可生物降解的特性，常被选为包封剂，成为合成聚合物的理想替代品。

全球多重耐药菌（MDR）危机导致感染者发病率和死亡率上升。随着耐药菌的增加和新抗生素的短缺，开发新型抗菌剂和治疗策略显得尤为迫切。药用和芳香植物具有数千年治疗历史，其提取的精油（EOs）因具备抗真菌、抗菌和抗病毒特性而被视为新型抗菌化合物。大量研究表明，精油的抗菌特性主要归因于萜烯、萜类和其他芳香成分。在众多精油中，茶树精油（TTO）作为一种有效的天然抗菌剂脱颖而出，其主要成分包括4-松油醇、γ-松油烯、α-松油烯、异松油烯和α-松油醇等。TTO具有无毒、无刺激和药理活性等特点，对多种细菌和真菌具有广谱抑制作用。

然而，精油的疏水性和挥发性限制了其生物利用度，它们在不稳定环境中容易蒸发和分解。为解决精油的挥发性问题并提高其持久性和功效，研究人员采用封装技术通过物理和/或化学相互作用将精油保存在外部基质中并调控其释放。可生物降解的微胶囊，特别是海藻酸钙微胶囊，因其能够控制药物释放和靶向递送而受到关注。

海藻酸钙微载体的制造过程相对快速简单，能为包封药物提供有效保护并实现良好的负载效果。释放后，海藻酸钙降解为水溶性寡聚物，随后被机体代谢排出。海藻酸钙可通过用Ca2?取代海藻酸钠（SA）中的Na?来合成。SA源自天然藻类，是一种阴离子多糖，由两种单糖组成：(1,4)连接的β-D-甘露糖醛酸（M块）和α-L-古洛糖醛酸（G块）。这种聚合物对二价离子（如Ca2?）高度敏感，阳离子取代聚合物链羧基上的钠离子，引发离子交联过程，形成稳定的“蛋盒”模型凝胶结构。

2. 材料与方法

2.1. 材料

海藻酸钠（(C₆H₇NaO₆)_n，粘度：350-550 mPa·s [1%，20°C]）购自Acros Organics（美国），氯化钙（CaCl₂，95%纯度）购自Thermo Scientific（德国）。澳大利亚茶树精油（药品级）从台湾高雄本地商店购买。Span 80（C₂₄H₄₄O₆）作为乳化剂，由First Chemical Works（台湾）提供。乙醇（C₂H₅OH，95%纯度）购自台湾糖业公司（台湾）。实验使用电阻率为18.2 MΩ·cm的去离子（DI）水进行。

2.2. 实验设计

实验采用单因素优化（OFAT）方法，每次测试只改变一个变量。实验参数包括SA溶液浓度（0.5、0.75、0.85、0.95、1、1.5和2 wt%）、收集距离（2、5和8 cm）和硬化时间（5、15和30分钟）。评估的关键特性包括粒径、精油包封率和后续释放行为。

2.3. 微载体的制备

TTO负载的海藻酸钙微载体制备分为两步：(1)制备单乳液（SA + DI水 + TTO + 乳化剂）；(2)与CaCl₂进行凝胶反应。首先将SA粉末与DI水混合磁力搅拌1小时，随后超声处理20分钟去除气泡。将0.6 g CaCl₂粉末溶解于40 mL DI水中制备1.5 wt%的CaCl₂水溶液。

为制备TTO负载微载体，将1 mL TTO（含0.6% Span 80）与9 mL不同浓度的SA水溶液在1500 rpm下磁力搅拌3小时均质混合。随后将10 mL油包水（o/w）乳液装入注射器，以1.5 mL/min的注射速率挤出乳液滴。CaCl₂水溶液（1.5 wt%，40 mL）作为交联剂，以300 rpm磁力搅拌。SA水溶液不断滴入CaCl₂溶液中，通过离子交联反应形成海藻酸钙微载体。经过指定固化时间后，收集微载体并用DI水洗涤两次以去除残留CaCl₂。洗涤后，微载体存储在0.06% CaCl₂水溶液中以防降解。

2.4. 表征方法

微载体在50°C烘箱中干燥48小时以完全去除水分。使用扫描电子显微镜（SEM）评估微观结构，加速电压为10 kV。使用光学显微镜观察核壳结构，并通过ImageJ软件测量微载体直径。每个实验组测量100个微载体，计算平均粒径。

使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）在400-4000 cm?1波数范围内研究SA粉末、CaCl₂粉末和微载体（未负载和TTO负载）中的化学键合。样品在55°C下干燥16小时完全去除水分，随后与光谱级溴化钾（KBr）一起研磨30分钟直至获得细粉末，最后压片进行FTIR测量。

2.5. 包封率与载药量测定

通过测量吸光度光谱量化微载体中TTO的含量。使用微孔板读数器在200-400 nm波长范围内扫描不同浓度的TTO标准溶液，发现在263 nm处有特征吸收峰。建立标准校准曲线后，将500 mg样品置于50 mL 95%乙醇中，以300 rpm搅拌12小时使微载体破裂释放所有包封的TTO。过滤后测量溶液吸光度，计算浓度。

包封率（EE）和载药量（LC）通过以下公式计算：

EE(%) = (实际包封TTO量 / 初始加入TTO量) × 100%

LC(%) = (微载体中TTO质量 / 微载体总质量) × 100%

2.6. 体外累积释放率

模拟体液（SBF）溶液根据Kokubo方法制备，模拟人体血浆中的离子浓度。将2 g TTO负载微载体加入10 mL SBF溶液中，在37°C振荡培养箱中以200 rpm振荡培养。在预定时间点取样，立即与等体积95%乙醇混合以溶解释放的TTO。最终TTO浓度经乙醇添加的稀释效应校正后计算。

考虑到伤口微环境在愈合不同阶段（包括慢性伤口、急性伤口和有坏死组织或脓液的伤口）的酸性特性（pH 4-6.5），研究使用SBF模拟两种条件：pH 5.5模拟酸性伤口区域，pH 7.0代表中性生理环境。

2.7. 药物释放动力学模型

释放数据拟合三种广泛使用的动力学模型：一级模型、Higuchi模型和Korsmeyer-Peppas模型。通过将原始数据拟合到相应方程计算每种情况的相关系数（R2）。

2.8. 储存稳定性

将微载体存储在0.06% CaCl₂水溶液中，室温（约27°C）保存12个月。使用与测定EE相同的方法量化储存稳定性。

2.9. 抗菌活性

使用大肠杆菌DH5α作为革兰氏阴性菌模型评估TTO负载微载体的抗菌活性。通过琼脂扩散法和液体培养法测试抗菌活性。在琼脂扩散法中，将100 μL细菌悬浮液均匀涂布在90 mm LB培养基琼脂平板上，TTO负载微载体通过超声振动分解并通过0.22 μm过滤器制备三种不同浓度（250、500和1000 mg/mL）的TTO提取物。将灭菌纸片浸泡在TTO提取物中，置于琼脂平板上，37°C培养24小时后测量抑菌圈直径。

在液体培养法中，将1 g TTO负载微载体与5 mL大肠杆菌溶液（10? CFU/mL）共培养，分别在37°C培养24和48小时，记录培养混合物的OD₆₀₀值。

2.10. 统计分析

使用Origin Pro 8.5.1进行数据分析和可视化。所有实验重复三次（n = 3），结果表示为平均值±标准偏差（mean ± SD）。使用GraphPad Prism软件进行单因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较检验评估样品与对照组之间的显著差异。

3. 结果与讨论

3.1. SA浓度的影响

光学显微镜观察显示，在固定收集距离2 cm和硬化时间5分钟条件下，低SA浓度（0.5%、0.75%和0.85%）的微载体内部直径为513-644 μm，提供相对较大的内部容量，但形状不规则，壁厚分布不均匀。随着SA浓度增加（0.95%-2%），微载体呈现更圆整的形状，球形完整性更高，壳厚度增加。SA浓度为1.5%和2%时，微载体表面出现明显皱纹，这与低粘力导致的快速聚集和藻酸盐链重新取向过程有关。

微球尺寸范围为620至772 μm，内核与外壳的体积比随SA浓度增加而增加。当SA浓度低于中间值时，交联网络的结构强度不足；当浓度超过中间值时，SA水溶液粘度增加，增强与CaCl₂水溶液的交联强度，易形成异质网络，进一步占据内部空间。

SA浓度对TTO的EE和LC影响显著。低SA浓度（0.5%、0.75%和0.85%）时，TTO的EE仅为25%-29%，LC为9%-11%。SA浓度增加到0.95%和1%时，TTO的EE上升至76%和82%，LC增加至27%和29%。SA浓度进一步增加到1.5%和2%时，TTO的EE下降至57%和50%，LC下降至20%和18%。这表明SA浓度与TTO的EE和LC呈正相关。

3.2. 收集距离的影响

收集距离为2、5和8 cm时，平均粒径随收集距离增加而增大。当液滴落入CaCl₂水溶液时，SA与Ca离子在界面发生快速离子交联反应，形成介于液态和固态之间的微载体。在固定搅拌速率下，剪切力会使微载体从液滴形状变形为蛋形，最终因表面张力效应变为球形。

随着收集距离增加，液滴的冲击力增加，导致微载体粒径增大。液滴从针头落入CaCl₂水溶液的过程中，其对溶液表面的冲击引起微载体变形，重力作用改变微载体壳的形状，从球形变为椭圆形或泪滴形。

收集距离对TTO的EE和LC影响出人意料，随着平均粒径（或收集距离）增加，EE和LC呈下降趋势，从82%降至52%，从29%降至19%。这可能是因为随着收集距离增加，乳液滴撞击交联溶液的冲击力增加，导致飞溅造成的乳液损失更高。

3.3. 硬化时间的影响

硬化时间为5、15和30分钟时，随着硬化时间延长，微载体直径和壁厚均增加。这种尺寸和厚度的增长对内核内TTO的包封和保留产生相应影响。延长硬化时间从5到30分钟，TTO的EE和LC略有上升，从82%到85%和29%到31%。

这些观察结果可归因于微载体硬化时间对外部钠钙插层凝胶形成以及内部保留TTO稳定性的关键影响。随着硬化时间延长，凝胶化增强提高了内部TTO的保留效率，导致EE和LC增加。这种现象与交联行为、微载体内聚力以及TTO在微载体和水相之间的分布状态有关。

3.4. 形态与微观结构表征

未负载微载体呈透明外观，而TTO负载微载体呈乳白色。干燥前TTO负载微载体的平均粒径为0.77 ± 0.06 mm，未负载的为0.65 ± 0.06 mm。SEM图像显示清晰的核壳结构，未负载微载体表面光滑，而TTO负载微载体呈现多孔表面纹理。多孔结构归因于TTO从微载体表面蒸发。尽管TTO的掺入导致多孔表面形态，但壳结构保持完整，没有破坏性内部孔塌陷或结构损害的迹象。

3.5. 官能团分析

FTIR光谱显示，SA粉末在3450 cm?1（O-H伸缩振动）、2928 cm?1（C-H伸缩振动）、2856 cm?1（C-H伸缩振动）、1615 cm?1（-COO?不对称伸缩）、1419 cm?1（-COO?对称伸缩）和1030 cm?1（C-O-C伸缩振动）处显示特征吸收峰。CaCl₂的Ca-O伸缩振动在509 cm?1处识别。

SA与钙离子交联形成海藻酸钙微载体后，1615和1419 cm?1处的吸收峰略微移至1611和1416 cm?1，表明Ca2?与藻酸盐羧基之间存在离子相互作用。纯TTO光谱在2856和2928 cm?1处显示明显峰，分别对应-CH₃的对称C-H伸缩模式和-CH₂的不对称C-H伸缩模式，均为萜类成分的特征。当TTO加入海藻酸钙微载体后，2856和2928 cm?1处的特征带变得更加明显，并在1739 cm?1处出现新峰，这些光谱变化为TTO成功包封在藻酸盐基质中提供了有力证据。

3.6. 体外释放行为与储存稳定性

3.6.1. 累积释放率

在pH 5.5和pH 7.0的SBF中进行240小时的TTO体外释放研究，释放行为可分为两个阶段：初始阶段的快速释放阶段（突释阶段）和随后的缓慢释放阶段。在最初3小时内，pH 5.5和pH 7.0下的快速TTO释放率分别为44%和30%，这一初始阶段通常称为突释效应。在第二阶段，缓慢释放在240小时内分别达到72%和75.9%。

pH 5.5和pH 7.0下累积释放率的差异可解释如下：藻酸盐是一种弱聚阴离子，pKa值为3.4，在pH < 3.4时发生质子化（-COOH），在pH > 4.4时去质子化（-COO?）。这导致聚合物链扩张和海藻酸钙微载体基质溶胀，这种效应随着pH值增加而增强，在约pH 7.4达到峰值。

3.6.2. 释放动力学

使用各种数学模型研究制备载体中药物的释放机制。零级动力学模型用于从不解体且缓慢释放药物的药剂剂型产生恒速药物释放曲线。一级动力学是用于阐明多孔框架中分散亲水药物的递送系统如何以依赖于载体内部剩余药物量的速率释放药物的模型。Higuchi动力学模型被广泛认为是研究掺入半固体和/或固体基质中的水溶性和低溶性药物释放的控释模型。

本研究中的累积释放曲线显示TTO释放不遵循严格线性模式，因此不考虑和讨论零级动力学模型。通过应用标准释放方程将实验数据拟合到一级模型、Higuchi模型和Korsmeyer-Peppas模型中分析TTO释放动力学。测试样品的释放动力学与Higuchi动力学模型最吻合，表现出最高的相关系数。结果表明TTO分子通过扩散机制从框架型微载体中逸出。

3.6.3. 储存稳定性

SA浓度为1%、1.5%和2%时，收集距离设为2 cm，硬化时间为5分钟，评估在CaCl₂溶液中室温储存12个月的TTO负载海藻酸钙微载体的储存稳定性。SA浓度为1%的微载体表现出最高的TTO保留率（75.7%），表明具有优异的储存稳定性。SA浓度增加到1.5%和2%时，TTO保留率分别降至52.3%和36.9%。这种下降可归因于用1.5%和2% SA浓度制备的微载体表面出现深皱纹。

3.7. 抗菌活性

使用1 wt% SA、2 cm收集距离和30分钟硬化时间参数进行抗菌活性测试。通过用DMSO作为溶剂分解TTO负载海藻酸钙微载体制备不同浓度的TTO提取物观察抑菌圈。随着提取物浓度从250增加到1000 mg/mL，抑菌圈从8.9 ± 0.1扩大到9.6 ± 0.3 mm，表明TTO负载微载体对大肠杆菌DH5α有显著抑制作用。

抗菌效果可能归因于精油中萜烯和萜类化合物的存在，这些化合物具有固有的抗菌特性，并在相互作用时实现破坏细胞膜的效果。然而，精油的疏水性和挥发性在噬菌体稀释法或纸片扩散法测试中是不可控因素，因此无法保证精油在微载体外部释放时的均匀分布和可持续性。

将TTO负载微载体与菌液共培养观察大肠杆菌DH5α的生长速率，发现用不同SA浓度制备的微载体在液体培养基中大肠杆菌DH5α的生长速率存在显著差异。SA浓度为1%的微载体对大肠杆菌DH5α生长的抑制最有效，在24和48小时分别导致10.5%和7.3%的细胞存活率。换句话说，在各自时间点测量到的抑制大肠杆菌DH5α的能力分别为89.5%和92.7%。性能变化可归因于SA浓度引起的EE%和LC%差异，其中1%浓度表现出良好的EE%、LC%以及长期释放特性。

4. 结论

本研究通过乳化-交联方法成功开发并优化了TTO负载海藻酸钙微载体，重点研究了SA浓度、收集距离和硬化时间对结构和功能特性的影响。采用1% SA、2 cm收集距离和30分钟硬化时间合成的微载体表现出最佳性能，实现了高EE（85% ± 0.7%）和LC（31% ± 0.5%）。

系统表征表明，SA浓度显著影响颗粒形态、核壳完整性和包封行为。形态和SEM分析证实了核壳结构，而FTIR验证了TTO的成功掺入且无分子降解。SBF中的体外释放研究显示双相释放模式，3小时内突释高达44%，240小时内持续释放超过75%。值得注意的是，释放曲线具有pH敏感性，在酸性条件（pH 5.5）下初始释放更明显，这与炎症伤口环境一致。动力学建模表明TTO释放遵循Higuchi扩散机制并表现出Fickian扩散行为。

此外，微载体对大肠杆菌DH5α表现出强抗菌活性，在液体培养模型中48小时抑制率高达92.7%。由部分TTO蒸发诱导的多孔表面形态不影响机械稳定性或储存性能。具体而言，微载体在储存12个月后保留75.7% ± 3%的TTO，表明其长期功能性。这种结构特性也可能有助于活性化合物的逐渐扩散，从而有助于持续抗菌抑制。

总之，本研究展示了一种优化的制备策略，将物理化学调控、长期储存稳定性、pH响应释放行为和生物学验证整合到一个统一的递送系统中。这些发现为天然精油的包封提供了宝贵见解，并拓宽了藻酸盐基微载体在持续释放抗菌应用中的潜力，特别是在伤口愈合和相关生物医学领域。