裸盖菇素生物合成在丝盖伞属与裸盖菇属中的迥异反应与酶学机制解析

本综述深入解析了丝盖伞属（Inocybe）与裸盖菇属（Psilocybe）蘑菇合成裸盖菇素（psilocybin, 1）的两条独立进化途径。研究通过体外生化实验与计算机模拟，证实两途径虽共享4-羟色胺（4-hydroxytryptamine, 5）为共同中间体，但催化反应顺序与关键酶（如脱羧酶IpsD/PsiD、激酶IpsK/PsiK、甲基转移酶IpsM1-IpsM2/PsiM）在进化起源、底物特异性及催化机制上均无关联，揭示了真菌次生代谢途径的平行进化现象，为天然药物生物技术开发提供了新酶库。

　　

引言

"神奇蘑菇"的主要天然产物裸盖菇素（4-磷酸氧基-N,N-二甲基色胺，1）是一种化学性质稳定的前体化合物，其去磷酸化产物psilocin（4）才是真正的精神活性化合物，通过高亲和力结合5-羟色胺（5-HT）受体（主要是5-HT_2A受体）干扰血清素能神经传递。该化合物的药用价值源于其作为候选药物治疗严重难治性抑郁症的潜力，在高级临床试验中展现出良好前景。

从L-色氨酸（2）生物合成1的途径在同名属裸盖菇属（Psilocybe）中已被彻底阐明。然而，某些丝盖伞属（纤维帽蘑菇）物种，如Corydalina丝盖伞（Inocybe corydalina），同样能产生1。早期的基因组分析表明，I. corydalina的基因组DNA并不编码裸盖菇属特有的psi基因簇，而是包含一个推定的、编码可执行相同催化功能但完全不相关的酶基因簇（ips基因）。

结果与讨论

脱羧酶IpsD的活性与结构模型

IpsD是一种依赖磷酸吡哆醛（PLP）的L-色氨酸脱羧酶。出乎意料的是，体外活性测定显示，IpsD不接受未取代的L-色氨酸（2）作为底物，但能高效催化4-羟基-L-色氨酸（7）近乎定量地转化为4-羟色胺（5）。其动力学参数显示催化效率（k_cat/K_M = 6.58 s^?1 mM^?1）虽低于裸盖菇属的PsiD，但与另一种真菌脱羧酶CsTDC相当。

结构模型分析揭示了IpsD严格底物选择性的可能原因。其AlphaFold 3模型与植物来源的色氨酸脱羧酶CrTDC（PDB 6EEW）的叠加显示，IpsD底物结合口袋中的一个关键残基替换（CrTDC的F100对应IpsD的Y79）创造了一个极性环境，可能通过结构弛豫与7的4-OH基团形成供体/受体相互作用，同时破坏了容纳未取代色氨酸芳香吲哚基团所需的疏水环境。这与裸盖菇属的PsiD形成鲜明对比，后者是一种PLP非依赖性的磷脂酰丝氨酸脱羧酶家族成员，在系统发育上完全无关，且催化途径的第一步。

单加氧酶IpsH的结构模型

推定的细胞色素P₄₅₀单加氧酶IpsH与裸盖菇属的PsiH仅具有29.6%的氨基酸序列同一性。其AlphaFold 3模型显示了一个典型的N端螺旋膜锚和一个额外的约13个残基长的非结构化N端延伸。与一个过氧化物酶（8YZ8）的结构叠加揭示，在推测的结合位点附近有一个不寻常的插入（围绕G310），这可能在其底物2的结合中起作用。由于大多数P₄₅₀单加氧酶不溶，IpsH未进行体外 assay，但机理原因将其定位为Ips途径的起始酶：IpsD的底物特异性排除了羟基化在脱羧之后发生，羟基化又必须先于磷酸酯形成，而脱羧不能发生在甲基化之后。

激酶IpsK的活性与结构模型

激酶IpsK负责引入1中非常罕见的磷酸酯基团。它与裸盖菇属的PsiK（属于硫核糖激酶家族）仅有22.4%的序列同一性。体外活性测定结果出乎意料：与优先磷酸化5生成去磷酸裸盖菇素（norbaeocystin, 8）的PsiK不同，IpsK仅能微量催化该反应。相反，IpsK能磷酸化多种甲基化底物，其中对完全二甲基化的底物4显示出最强的偏好性，能将其定量转化为1。其动力学参数表明，IpsK对4的催化效率（k_cat/K_M = 33.51 s^?1 mM^?1）是对单甲基化底物10（k_cat/K_M = 1.09 s^?1 mM^?1）的30倍以上。

结构模型比较显示，IpsK与PsiK的C端结构域可以对齐，但N端结构域在各自模型中的取向显著不同，表明结构域重新定向在ATP/ADP加载/卸载和底物处理过程中可能起关键作用。IpsK作为最终生物合成酶的功能，意味着与裸盖菇属的情况相比，甲基化和磷酸转移的顺序是相反的。

甲基转移酶对IpsM1和IpsM2

与裸盖菇属仅编码一个甲基转移酶PsiM不同，I. corydalina的ips基因簇编码两个近乎相同的甲基转移酶（IpsM1和IpsM2，93.1% identical）。它们属于甲基转移酶家族25，与PsiM（家族10）或TrpM（家族33）在系统发育上无关。

体外实验证实两者均具有活性，但催化特性存在定量差异。两者都能以5为底物催化两次连续的甲基转移反应，生成10和4。然而，IpsM1倾向于催化第二次甲基化，以10为底物生成4为主要产物；而IpsM2则倾向于催化第一次甲基化，以5为底物生成10为主要产物。动力学分析支持了这一分工：IpsM1对10的催化效率高于对5；而IpsM2对5的催化效率远高于对10。更重要的是，两者均拒绝任何磷酸化的底物（如8, 3, 1），这与PsiM以磷酸化底物（8和3）为最佳底物的特性形成根本区别。

多酶活性测定

多酶组合实验验证了上述途径。以7为起始底物，包含IpsD、IpsK、IpsM1和IpsM2的一锅法反应成功生成1为主要产物，并伴有少量中间体5、10、4和支路产物3。当仅使用IpsM1时，仍能生成1为主产物；而当仅使用IpsM2时，3成为主要产物，1的产量很低。这证实了途径的分支特性，并表明这两个甲基转移酶的功能并非简单冗余，而是构成了一个精细平衡的系统：IpsM1（催化第二次甲基化）对于确保1的生产至关重要，而IpsM2（催化第一次甲基化）主要负责提供前体10。IpsK对底物4和10的催化效率差异以及它与甲基转移酶对共同底物10的竞争，共同决定了最终产物1和3的比例。这解释了为何在I. corydalina子实体中，1和3常被同时检测到，且3有时含量更高。

结论

本研究从生化层面证实，担子菌门伞菌目（Agaricales）内部的裸盖菇素（1）和巴约辛（baeocystin, 3）生物合成能力是两次独立进化事件的结果。丝盖伞属（Inocybe）和裸盖菇属（Psilocybe）招募了远缘或完全无关的酶，这些酶具有不同的底物特异性，导致了截然不同的生物合成事件顺序：羟基化与脱羧的顺序相反，甲基化与磷酸化的顺序也相反。两条途径共享4-羟色胺（5）作为唯一共同的中间体，但除此之外，没有任何一个反应是两者共有的。

这一发现是次级代谢产物平行进化（convergent evolution）的典型例证。考虑到丝盖伞属（外生菌根共生）和裸盖菇属（腐生于木材或粪肥）遵循不同的生活方式并占据不同的生态位，此发现有助于生态学家进一步揭示其真正的进化选择压力。此外，Ips酶系的发现和表征为未来可持续生物技术生产裸盖菇素这一候选药物提供了宝贵的新酶库和策略。