LNA电荷中性骨架的合成与生物活性研究：增强型剪接转换反义寡核苷酸的分子动力学模拟与应用前景

本文系统探讨了将锁核酸（LNA）与多种电荷中性骨架（如酰胺、氨基甲酸酯、烷氧酰胺和磺酰胺）结合用于反义寡核苷酸（ASO）设计的创新策略。研究通过综合运用合成化学、分子动力学（MD）模拟、热稳定性测定及细胞水平剪接转换活性分析，揭示LNA-磺酰胺骨架在增强双链稳定性、提高细胞摄取效率及剪接校正活性方面的显著优势，为开发高效、低毒的新型核酸 therapeutics 提供重要理论依据和实验基础。

　　

引言

反义寡核苷酸（ASO）已成为治疗多种遗传性疾病的重要 therapeutic 手段，尤其在剪接转换应用领域（如脊髓性肌萎缩（SMA）和杜氏肌营养不良（DMD））显示出显著临床潜力。然而，ASO的细胞膜穿透能力差、体内分布不理想等问题限制了其广泛应用。化学修饰是改善ASO成药性的关键策略之一，其中2′-烷氧基修饰（如2′-O-甲基，2′OMe）和硫代磷酸酯（PS）骨架能增强双链稳定性和核酸酶抗性，但高负电荷仍影响细胞摄取效率。电荷中性骨架（如酰胺、氨基甲酸酯）能减少静电排斥并增加脂溶性，但常导致双链稳定性下降。锁核酸（LNA）通过锁定糖环的C3′-内型构象显著提高与RNA的结合亲和力。本研究将LNA与多种电荷中性骨架结合，系统评估其物理化学性质、结构特征及生物学活性，旨在开发新型高效ASO修饰策略。

结果与讨论

5′-O-DMTr保护修饰二聚体磷酰胺的合成

研究团队成功合成了四种LNA-电荷中性骨架二聚体磷酰胺单体：LNA-酰胺（11）、LNA-氨基甲酸酯（13）、LNA-烷氧酰胺（15）和LNA-磺酰胺（17）。其中LNA-酰胺通过HATU介导的酸3与胺1偶联获得二聚体10，再经磷酰化制得（收率52%）。LNA-氨基甲酸酯通过醇2与CDI反应生成活性中间体，再与胺1缩合后磷酰化（收率57%）。LNA-烷氧酰胺的合成涉及N³-苯甲酰保护、烷基化和酰胺偶联多步反应（总收率约35%）。LNA-磺酰胺通过4-硝基苯活化的磺酰胺中间体9与醇2反应，经TBS脱保护后磷酰化制得（收率65%）。所有合成路线均经过优化，确保了单体的高纯度和固相合成兼容性。

分子动力学（MD）模拟

通过3 μs的MD模拟比较了五种系统（天然磷酸二酯、LNA-磷酸酯及四种LNA-电荷中性骨架）在10-mer DNA/RNA异源双链中的构象稳定性。结果显示所有修饰系统均能维持稳定的双链结构，内部6个碱基对的RMSD分布与天然系统相似（1.5–2.5 ?）。LNA-酰胺系统表现出最低的RMSF值，表明其构象刚性最强。二面角分析表明LNA-磺酰胺的构象灵活性最高，其C3–C5距离分布（SD=0.32 ?）最接近天然磷酸二酯系统。氢键分析显示，LNA-氨基甲酸酯对5′端胸苷的氢键破坏最大（降低13%），而LNA-磺酰胺反而轻微稳定了相邻未修饰碱基的氢键网络。这些计算数据为实验观察到的热稳定性差异提供了结构基础。

寡核苷酸合成与物理性质

采用标准固相合成法成功制备了五种ASO（ON1-5），序列针对HeLa pLuc/705细胞系的剪接转换位点设计。ON1为2′OMe/PS对照，ON2-5分别包含两种LNA-电荷中性骨架修饰（位置如图3a所示）。紫外熔解实验显示，与RNA靶标结合时，LNA-酰胺（ON2）和LNA-磺酰胺（ON5）分别带来+4.2°C和+10.0°C的_m升高，而LNA-氨基甲酸酯（ON3）和LNA-烷氧酰胺（ON4）仅引起轻微变化（-1.5°C至+1.7°C）。圆二色谱（CD）表明所有修饰均保持A型或A/B混合型双链构象，其中LNA-磺酰胺系统显示出独特的280 nm正峰红移，提示构象灵活性增加。核酸酶稳定性实验证实所有修饰ASO在96小时人血清孵育后均保持完整，与2′OMe/PS对照相当。

剪接转换活性分析

在HeLa pLuc/705报告基因模型中，转染实验（12.5–100 nM）显示LNA-酰胺（ON2）和LNA-磺酰胺（ON5）的活性显著高于2′OMe/PS对照（ON1），分别提高约2倍和3倍。无转染剂 gymnosis 实验（0–20 μM）进一步证明LNA-磺酰胺（ON5）的细胞摄取和剪接校正效率远超对照及单纯LNA修饰的ASO（如LNAx4b）。毒性实验表明所有修饰ASO均无显著细胞毒性。值得注意的是，LNA-磺酰胺在保持高活性的同时，其合成路线显著简化（仅需从商业可得原料2出发），更具实际应用潜力。

结论

本研究首次系统比较了LNA与四种电荷中性骨架组合对ASO性能的影响。实验与模拟数据一致表明LNA-磺酰胺骨架在双链稳定性、构象灵活性和生物活性方面均表现优异，其 gymnosis 活性显著优于现有临床标准修饰。该修饰不仅合成路线简洁，还可能通过减少磷硫酰含量降低蛋白非特异性结合风险。未来研究将聚焦于LNA-磺酰胺在RNase H gapmer及siRNA中的应用，并深入评估其体内药代动力学和毒理学特性，为推动新一代核酸 therapeutics 发展提供重要支撑。

作者贡献

A.K.、L.L.和B.Z.K.负责小分子合成（A.H.E.S.和Y.R.B.指导）；A.H.E.S.、T.B.和D.D.完成寡核苷酸合成；A.K.、L.L.和D.D.负责纯化；M.F.（F.D.指导）完成计算工作；A.K.、L.L.、A.H.和A.R.（M.J.A.W.实验室）完成生物学实验；L.L.在T.B.、Y.B.和A.H.E.S.指导下工作；手稿由A.K.、L.L.、M.F.和T.B.撰写。

利益冲突

T.B.和A.H.E.S.为牛津大学创新公司于2025年2月27日提交的美国专利63/764021的发明人。