溶剂通道与电场引导质子传递至血红素过氧化物酶活性中心的机制研究及其在催化中的保守性

本综述通过结合经典、量子及混合计算方法，揭示了血红素过氧化物酶（如APX）中保守的溶剂通道（γ和δ边缘）和局部电场（LEF）如何协同引导质子传递至活性中心，为理解酶催化中质子耦合电子转移（PCET）机制提供了新视角，对酶工程和药物设计具有重要启示。

　　

引言

血红素酶是一类强大且多功能的催化剂，能够利用O₂或H₂O₂以及电子和质子源进行多种氧化反应。在H₂O₂依赖的氧化反应中，即血红素过氧化物酶，氧化机制已被广泛研究，但伴随O─O键断裂及后续底物氧化过程中的质子传递机制仍不明确。理解质子和电子的运动对于未来设计定制血红素催化剂至关重要。中子衍射技术为一些血红素过氧化物酶提供了结构数据，能够直接可视化氢原子位置，但无法揭示质子的起源或其催化过程中的动态运动。尽管已有计算研究关注过氧化物酶和细胞色素P450酶与H₂O₂的反应性，但主要集中于关键化合物I中间体的形成及水分子效应，对质子传递动力学的理解进展甚微。

本研究应用计算化学方法探究多种血红素过氧化物酶中的质子传递机制。评估了抗坏血酸过氧化物酶（APX）中溶剂向活性位点供应质子的潜在机制，并鉴定了从血红素边缘引导质子传递的溶剂通道。同时分析了活性位点电场，发现电场被定向塑造以促进质子沿这些通道传递。对其他血红素过氧化物酶的分析表明，这些通道是保守的，且沿通道的静电预组织是该家族的普遍特征。

结果与讨论

特定质子通路中质子运动的检验

中子晶体学对抗坏血酸过氧化物酶（APX）与底物抗坏血酸复合物的研究揭示了从底物（结合在γ-血红素边缘）到血红素铁的连续氢键通路。在此通路中，保守的Arg38残基起关键作用，但在中子结构中观察到其为中性（未质子化）胍氨酸形式，而非通常认为的蛋白质中精氨酸残基的主要质子化胍鎓形式。然而，多个中子结构被解释为显示中性精氨酸侧链，正如我们先前工作中讨论的。检查晶体结构中的氢键未发现任何有利于Arg38去质子化的特征。因此，我们首先进行量子力学计算以评估Arg38在质子传递中的潜在作用。

使用密度泛函理论（DFT）计算研究了APX活性位点关键残基的“簇”模型，包括Arg38的中性和带正电状态。起始几何结构使用了中子结构中建模的Arg38互变异构体。我们还考虑了其他互变异构体和所有可能的多重态。这些残基和水分子是支持催化过程中从底物到血红素质子转移的氢键网络的关键组成部分。

我们使用DFT计算了Arg38在蛋白质局部环境中的质子亲和力，受簇模型的限制。我们首先使用胍和精氨酸分子验证了理论水平，因为这些分子的实验（气相）质子亲和力可用。随后，我们使用相同方法评估了Arg38在活性位点局部蛋白质环境中的质子亲和力，测试了环境和介电效应，分别使用了水的连续溶剂模型和ε=4的隐式溶剂（代表蛋白质环境效应的典型值，用于酶研究中的DFT簇模型）。在连续溶剂或蛋白质模型中，所有物种的质子亲和力绝对值较低，但趋势和结论相似。这些计算表明，Arg38周围的局部活性位点结构并未显著降低质子亲和力，且Arg38的质子化形式比中性形式稳定得多，表明中子结构中识别的中性Arg38形式可能反映瞬态状态而非生理条件下的最 populated形式。

我们随后应用QM/MM计算在DFT QM水平上进一步测试扩展蛋白质环境对质子亲和力的影响，并量化到Arg38的特定质子运动。DFT/MM优化几何结构（源自MM分子动力学（MD）模拟快照）与晶体结构紧密相似，重原子RMSD约为0.6 ?（它们也与取自MM MD的几何结构相似，表明MM几何结构合理）。DFT/MM Mulliken电荷和自旋密度，有和没有MM点电荷，显示无显著差异，表明超出先前考虑簇的扩展蛋白质环境未显著极化反应中心。DFT/MM几何结构与晶体结构的主要差异在于活性位点水分子的位置，这些水分子移动和重新取向，并依赖于MD的起始帧。

使用与DFT簇结构相同的程序，但应用于几个DFT/MM结构，我们计算了质子亲和力值，所有值都明显有利于Arg38的质子化形式。值得注意的是，一些选定快照的DFT/MM几何优化在从中性Arg38开始时导致显著的结构重排，并在 several cases中，通过一系列耦合质子转移自发质子化Arg38。这些结果为沿此质子转移通路的特定质子运动提供了直接见解。在一个实例中，Arg38从邻近水分子（W^g，视为QM）接收质子。W^g然后从第二个水分子（W^c）拉取质子，后者又从铁结合水分子（W^b）接收质子。这些计算提供了从远端水分子（W^b）到Arg38质子转移的证据，导致Arg38质子化，代价是W^b（形成铁氢氧化物物种）。不同帧的DFT/MM优化导致中性Arg38从互变异构体1自发转变为互变异构体3，由附近水分子促进。这些DFT/MM计算表明，当W^c和W^g占据图示位置时，质子从Arg38的N^ε通过水链转移到Arg38的N^η是有利的，将Arg38从一种互变异构体转换为另一种。DFT/MM优化结构和显示每个过程的视频在支持信息中提供。

尽管质子亲和力计算表明Arg38的中性状态仅是瞬时的，但QM/MM计算提供了质子转移网络连接Arg38和远端水的直接证据。Arg38能够接受和捐赠质子，并可以在不同互变异构形式之间转换。这突出了活性位点水分子的重要性。而且，水分子必须正确排列才能发生质子转移：只有它们适当定位和取向时，质子转移才能发生。

质子传递通道的鉴定

我们接下来对APX进行了MD模拟，Arg38处于质子化和中性状态，以检查活性位点的溶剂可及性并鉴定其他可能的质子通道。作为比较，我们还对另外两种铁过氧化物酶进行了等效的MD模拟：细胞色素c过氧化物酶（CcP）和辣根过氧化物酶（HRP），Arg38或等效残基质子化。此外，我们使用CAVER 3.03分析了这些系统的晶体结构和MD轨迹。CAVER用于基于几何标准检测可能的内部通道，MD模拟评估了这些通道是否充分水合且结构稳定，以允许水和因此质子在动态条件下传输。

APX的MD模拟，无论Arg38的质子化状态如何，揭示了充分水合的血红素活性位点，平均约五个水分子 within two 8 ? spheres centered on the N^η1 of Arg38 and the Fe atom。水分子占据与中子结构一致的位置；它们在模拟时间尺度上相互交换。我们的分析鉴定出两个 distinct channels，δ-和γ-通道，可能促进质子转移到活性位点，如下所述。

δ-通道：APX的MD模拟揭示了多个清晰、未断裂的连续（氢键连接）水分子链，形成从δ-血红素边缘的表面溶剂到活性位点中心（定义为配位血红素铁的氧原子）的通道。这些连续水链与CAVER在δ方向识别的红色通道良好对齐。该通道使用CAVER中默认的0.9 ?探针和增加的探针半径1.4 ?（近似水分子的范德华半径）检测到。这表明沿通道有足够空间允许水分子的存在和动态交换，而非严格单 file排列。这与MD模拟中观察到的水网络一致，可支持通过扩展氢键网络的质子转移。该通道允许水分子在血红素铁和溶剂之间交换，在其他过氧化物酶（CcP和HRP）中是保守的，如我们的模拟和分析所示。

将通道识别和MD模拟结果 together表明质子可以在蛋白质表面和血红素铁之间流动，但数据未提供关于此流动方向性 nor驱动力的信息。

我们然后测试了通过δ方向溶剂通道的潜在质子通路和转移方向，使用QM(DFTB2)/MM-Umbrella Sampling反应模拟。这些模拟显示了质子从溶剂（在δ-血红素边缘）到His42的转移。该转移与结合抗坏血酸的存在或Arg38的质子化状态无关，因为这些未包含在计算的QM部分且远离质子通路。尽管经典动力学处理质子转移存在局限性（如缺乏量子隧穿和零点能），这些模拟表明质子从δ-血红素边缘的远处溶剂到His42的转移是有利的。

γ-通道：观察γ-血红素方向的质子传递，在MD计算中 rarely观察到从γ-血红素边缘的蛋白质表面到血红素的连续水分子链，尽管在少数孤立帧中观察到。然而，在Arg38的两侧频繁观察到水链（一侧通向血红素铁，另一侧朝向蛋白质的γ-边缘）。这些形成由水分子和Arg38组成的潜在质子通路（无论Arg38的质子化状态）。CAVER仅在罕见帧中识别出1.4 ?探针通道，其中临时蛋白质运动允许水链形成，但这不常见。然而，当使用0.9 ?探针时，在γ方向一致检测到溶剂通道。这表明尽管在此方向水分子的通道受限，但通过单 file水分子链和极性残基（如Arg38）的Grotthuss机制质子转移是可能的。

APX中质子传递的方向性

我们使用局部电场（LEF）计算进一步评估了这些通道中质子运动的方向性。LEF基于电荷分布量化蛋白质中的局部电场，并已知是量化质子传递机制的有用工具。这是因为电场矢量从正电荷区域指向负电荷区域，带正电质子沿电场相同方向移动（正到负）。这意味着局部电场的量化可以报告等效的质子运动，并提供方向信息。

我们首先调查了γ-通道是否静电预组织以及这是否影响潜在质子转移的方向性。我们量化了APX中沿γ-通道的LEF，针对Arg38的质子化状态和三种中性互变异构体。我们使用LEF测量从蛋白质表面到血红素铁沿γ-通道三个关键点的静电梯度和方向性：a) 在水分子W^f的位置；b) 在W^f和Arg38的C^z原子之间的中点；c) 在Arg38的C^z原子。观察到电场幅度从表面向血红素铁方向移动（点a到c）清晰减少。对于中性Arg38互变异构体也观察到类似电场幅度向血红素方向的减少，尽管由于中性Arg38的 altered电荷，电场幅度略有不同。这种电场梯度的效应，就质子运动而言，是从表面到血红素铁方向存在从正到负的静电漏斗，引导质子沿γ-通道从蛋白质表面到血红素铁。这种陡峭梯度和矢量取向在所有MD快照中一致。这些结果不仅强化了γ-通道在指导质子迁移中的作用，而且显示了沿此通道转移的驱动力。电场的这种聚焦和方向似乎是支持沿γ-通道质子转移的机制。从蛋白质表面到血红素铁的一致方向性表明，蛋白质内的电场是进化定制以促进电荷迁移到APX的活性位点。此概念的普遍性在其他过氧化物酶中的探索如下。

其他过氧化物酶中的质子通道

为探究在APX的γ-通道中观察到的静电预组织是否是血红素过氧化物酶家族的共同特征，我们对家族中 several other enzymes（HRP, CcP, manganese peroxidase (MnP), dye decolorizing peroxidase (DyP), lignin peroxidase (LiP), myeloperoxidase (MPO), lactoperoxidase (LPO), and Arthromyces ramosus peroxidase (ARP)）应用了LEF分析。此分析还包括 conserved distal arginine位置在这些酶中变化的 structures，并捕获了 distal arginine的“in”和“out”构象。使用每种过氧化物酶的晶体结构，我们基于它们的铁结构与铁APX的结构比对鉴定了γ-通道，然后以与APX相同的方式计算了沿通道的LEF。在所有考虑的过氧化物酶中，我们观察到沿γ?通道电场幅度清晰减少，LEF幅度向血红素活性位点方向减少。而且，这些LEF矢量一致地从表面指向血红素铁，形成与APX中观察到的类似的一致静电漏斗。在检查APX、HRP和CcP的化合物I和II中间体的晶体结构时也观察到这一点。值得注意的是，虽然电场方向在所有检查的血红素过氧化物酶和氧化态中一致，但电场的幅度和梯度变化，表明电场的调谐可能影响质子传递的效率并反映不同过氧化物酶中的功能适应。

上述LEF分析揭示了一致静电漏斗引导质子运动，突出了过氧化物酶家族中静电预组织。为理解这些场在蛋白质结构背景下的空间排列，电场线的可视化非常有用：这可以揭示电场线如何组织以指导质子运动。对于APX鉴定的质子传递的γ-和δ-通道的存在，也在所有其他检查的过氧化物酶中鉴定到。值得注意的是，在所有情况下，δ-通道附近的电场线以引导水分子进入空腔的方式排列，这与QM(DFTB2)/MM-umbrella sampling和MD模拟的结果一致。对于δ-通道，这易于以2D格式可视化，因为过氧化物酶中的δ-血红素边缘暴露于溶剂，且 leading into the heme active site的电场线在所有检查的过氧化物酶中清晰观察到。电场线的这种组织在γ-通道的等效2D视图中较难可视化，因为2D视图无法传达通过蛋白质内部的电场线的空间排列。我们因此使用沉浸式3D可视化平台（UnityMol）在虚拟–现实兼容环境中渲染电场线。这种沉浸式方法允许观察者旅行 inside the protein以追踪从γ-通道入口 down to the active site的电场线路径。电影显示了三 representative过氧化物酶（APX, HRP, and CcP）的γ-和δ-通道的这些电场线路径。这些3D沉浸式可视化确认电场线从表面延伸到铁 in both channels，形成连续静电漏斗以拉取质子通过通道朝向铁。

讨论

所有氧化血红素酶使用氧（O₂）或其还原等效过氧化氢（H₂O₂）形成反应性铁酰中间体，这是它们氧化能力的基础。这些中间体， common to all known heme oxidative enzymes，自1930年代以来已被研究。在鉴定它们的结构和反应性方面已取得 significant progress。自铁酰中间体发现以来已过去数十年，但伴随O─O键断裂及后续血红素被还原底物还原的质子转移机制在许多情况下仍 largely unknown。特别地，质子的精确起源—— whether they originate from active site residues, the substrate, or elsewhere—尚未普遍建立。类似地，水分子在活性位点内和连接到溶剂的作用，作为质子迁移的潜在导管以及它们在催化循环中的进入和退出点，尚未很好理解。即使在连续氢键通路已被鉴定为质子传递的合理路线的情况下（如血红素加氧酶，细胞色素c氧化酶，细胞色素P450，MauG，细胞色素bc1和APX），也不清楚这些是否广泛代表其他血红素酶。

这项工作中最重要的发现之一是QM(DFT)/MM计算显示了APX中保守活性位点精氨酸Arg38与周围水分子之间动态质子交换的可行性，也促进了中性形式中Arg互变异构体的相互转换。计算还表明，中性Arg38可以根据局部瞬时条件接受质子。结果表明，胍基团可以改变其互变异构状态以支持动态质子转移事件，在活性位点中水分子位置保持 approximately constant。这与Arg38在从γ-血红素边缘到血红素的质子传递中的作用一致。以此方式作用，Arg38需要作为连接底物到血红素的质子转移网络的一部分，在质子化（胍鎓）和中性（胍）形式之间相互转换。DFT簇模型和QM/MM计算均未显示Arg38的pK_a降低，因此Arg38的中性形式可能仅作为溶剂介导质子转移管道的一部分瞬时存在。越来越多的证据表明精氨酸可以作为酸 function并在生理条件下至少在蛋白质中瞬时存在。我们注意到在另一种四吡咯结合蛋白（光传感器蛋白RcaE）中，活性位点赖氨酸残基已被证明是中性的，并在质子化状态之间切换。在APX（及潜在其他过氧化物酶）的情况下，实质性点是 several different methods的结果表明，通过活性位点网络（包括水和 via Arg38）的质子运动是机械可行的。

就质子通道而言，MD和QM(DFTB2)/MM计算清晰显示了稳定、连续、质子转移通道的存在，连接溶剂（在δ-血红素边缘）到血红素，在所有检查的过氧化物酶中。此通路包括充分水合通道，包含从活性位点中心到溶剂的水分子，His42作为控制质子供应的开关残基起重要作用。有 strong evidence表明底物在血红素过氧化物酶中结合在多个位置，包括在δ-血红素边缘和潜在其他表面位置。有效的质子传递机制需要完成氧化反应。我们的观察提供了由δ-血红素边缘水分子介导的质子传递的证据，这与血红素过氧化物酶家族（所有氧化有机底物）相关。CAVER分析和MD模拟还鉴定了到γ-血红素边缘的第二个质子通道。这为血红素过氧化物酶中活性位点质子传递提供了两种可能性，我们解释为两种溶剂通道 generically useful。

LEF分析表明，γ-和δ-通道都可以 contribute to质子运动，在APX和其他过氧化物酶中。电场塑造以驱动质子沿溶剂通道转移似乎是过氧化物酶的普遍特征，并可能在其他类似蛋白质中重要。δ-通道中电场线的相干方向和紧密堆积显示了良好排列的静电环境，促进水介导质子转移。γ-通道显示强、定向电场从蛋白质表面指向血红素铁。 together，这些观察表明电场沿两种溶剂通道静电预组织以支持质子传递。这些结果强调了静电在引导电荷——此处，质子迁移——中的更广泛作用。它们还强调VR增强的3D可视化如何提供在传统2D表示中 often obscured的直观空间见解。

我们的发现与血红素酶家族中的其他证据一致（例如，对于细胞色素P450）显示局部电场是通过调节和定义质子和电子转移通路及稳定反应中间体的催化效率的关键决定因素。我们的发现也与对其他酶的观察一致，表明蛋白质中的电场通过进化优化用于特定催化功能。类似水合控制质子转移机制已在其他氧化还原酶中报道，如细胞色素c氧化酶和呼吸复合物I，其中基于构象动力学和静电预组织的内部空腔水合以引导质子运动，方式概念上类似于我们的发现。

结论

过氧化物酶催化中还原血红素所需的两个质子的来源通常被假定源自底物，因为过氧化物酶底物被形式ally considered作为氢原子供体（即，提供电子和质子）。我们的结果表明，这种质子耦合电子传递模型是 oversimplification，不代表动态、水合血红素酶中的真实图景，其中底物位于表面而非 within hydrogen bonding distance of the heme。相反，我们在此证明了开放溶剂通道的存在，通过所需质子可以从溶剂传递。进一步，我们发现蛋白质中的电场被塑造和聚焦以引导质子沿这些溶剂通道进入活性位点，且这是所有检查的过氧化物酶的特征。总体，此质子传递模型 appears to be quite general且潜在相关于天然和 de novo血红素酶的设计和工程。