肥胖与正常体重人群中肠道菌群源性短链脂肪酸与血清转氨酶持续升高的关联性研究：一项初步探索

本研究发现，肥胖合并血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）持续升高人群的粪便短链脂肪酸（SCFAs）浓度显著升高，且与特定产SCFA菌属（如Roseburia）丰度呈正相关。该研究通过气相色谱和16S rRNA测序技术，揭示了肠道菌群代谢产物在非酒精性脂肪肝病（NAFLD）发病中的潜在作用，为代谢性肝病的机制研究和干预策略提供了新视角。

　　

引言

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）已成为全球性的健康问题，成人患病率高达25%–30%，且拉丁美洲人群（包括墨西哥）的NAFLD及其相关心脏代谢风险因素患病率更高。作为肝功能的重要生物标志物，血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平常用于评估慢性肝病（包括NAFLD）患者的肝脏炎症和损伤。虽然肥胖是NAFLD最常见的风险因素，但正常体重个体也可发生NAFLD，提示其病理生理机制可能存在差异。

肠道菌群失调引起的代谢物失衡也被认为是NAFLD的风险因素之一。短链脂肪酸（SCFAs）如乙酸、丙酸和丁酸是肠道菌群发酵未消化纤维和碳水化合物的产物，在NAFLD和肝纤维化患者的循环和粪便中均被发现升高。然而，部分研究却报道NAFLD患者SCFA浓度降低，这种差异可能与肥胖状态、性别、饮食和肠道菌群等多种混杂因素有关。

尽管SCFA浓度及其产生菌的增加通常与更好的代谢特征相关，但也有研究表明SCFA过度产生可能通过增加能量生成促进肥胖。因此，SCFA水平与肝脏脂肪变性之间的关联可能受到肥胖存在的干扰。本研究旨在探究正常体重和肥胖人群中，粪便SCFA浓度及其产生菌与血清ALT水平及肝脏脂肪变性之间的关联。

材料与方法

研究设计

本研究采用巢式病例对照设计，基于墨西哥卫生工作者队列研究（HWCS），比较了30名肥胖成人（18名ALT持续升高[Ob-E ALT]和12名ALT正常[Ob-N ALT]）与14名正常体重成人（7名ALT持续升高[Nw-E ALT]和7名ALT正常[Nw-N ALT]）的粪便SCFA浓度。所有参与者均满足以下纳入标准：成年男女（>18岁）；肝脏超声确认ALT升高者存在肝脏脂肪变性，而ALT正常者不存在；无显著饮酒史，无肝脏脂肪变性的竞争性病因或慢性肝病的共存原因。

膳食评估

采用先前在墨西哥人群中验证的半定量食物频率问卷（FFQ）评估习惯性膳食摄入。将每日摄入的蛋白质、碳水化合物和脂质的克数转换为千卡，并以每日能量摄入的百分比表示各宏量营养素的消费量。总膳食纤维摄入量以克为单位，按1000千卡标准化以减少个体间能量摄入变异。

粪便SCFA定量

粪便样本收集于无菌容器中，冷链运输并储存于-80°C直至处理。从75毫克粪便获得的水样中测量乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸和异戊酸的浓度。加入盐酸将水样pH调节至2.0，室温孵育10分钟后，以14,000 rpm离心10分钟。取1微升上清液以无分流模式注入气相色谱仪（Agilent Technologies 7820A型），配备火焰离子化检测器和毛细管柱。基于保留时间使用参考标准品鉴定各SCFA。通过Grubbs检验排除三个异常值（两个来自Ob-E ALT组，一个来自Nw-N ALT组）。SCFA粪便浓度以毫克/克粪便湿重表示，总SCFA浓度定义为各SCFA之和。

DNA提取与16S rRNA测序

使用QIAamp DNA Stool试剂盒提取DNA，并通过FastPrep设备进行机械裂解。通过分光光度计测定DNA浓度和纯度。使用515F和806R引物对30名参与者（5名Nw N-ALT、6名Nw E-ALT、8名Ob N-ALT和11名Ob E-ALT）的16S rRNA基因V4高变区进行测序。文库在Illumina MiSeq 2×250平台上测序。

序列数据处理

使用QIIME2流程处理配对末端原始文件。使用DADA2软件去除适配器、条形码错配和低质量读段（Phred值<30），采用“共识”方法去除嵌合序列，并去噪获得扩增子序列变异（ASVs）。使用SILVA v138-99参考数据库进行物种分类，通过MAFFT算法对齐ASVs。所有文件和元数据导入R环境，生成phyloseq对象，并通过稀释至37,000高质量读深进行标准化。

生物信息学分析

在R环境中进行数据分析。通过plot_richness函数估计Alpha多样性指数（观测ASV和Shannon指数）。使用加权和非加权UniFrac距离估计Beta多样性，通过Vegan包中的adonis2函数进行PERMANOVA分析（999次置换）。通过线性判别分析效应大小（LEfSe）评估从门到属水平的微生物组成差异，LDA得分>2.0且p<0.05视为显著。

统计分析

使用Kruskal–Wallis和事后Dunn多重比较检验或Mann–Whitney U检验比较定量变量，使用卡方检验比较分类变量。通过Spearman相关系数计算SCFA浓度与生化、膳食测量值以及属相对丰度与SCFA浓度之间的相关性，并通过错误发现率方法校正p值。根据现有研究人群固定样本量，并基于本初步研究结果计算未来研究所需样本量。

结果

肝脏脂肪变性中的粪便SCFAs

研究组的 anthropometric 和生化特征如表1所示。血清ALT、AST和葡萄糖水平在各组间存在显著差异，ALT持续升高和肝脏脂肪变性者较高（无论肥胖与否）。Ob-E ALT受试者的中位年龄较低，而Ob-N ALT组的女性参与者比例最高（91.7%）。各组间总胆固醇或甘油三酯血清水平无显著差异，FFQ评估的总热量、膳食纤维摄入量或宏量营养素比例也无差异。

如图1所示，Ob-E ALT个体的总SCFA及各SCFA（丙酸、丁酸和戊酸）浓度最高，Nw-N ALT个体最低，校正多重比较后差异显著（p<0.05）。肥胖个体（无论ALT水平和肝脏脂肪变性如何）的总SCFA及乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和异丁酸浓度均显著高于正常体重个体（校正多重比较后p<0.05；图2）。丙酸、丁酸和戊酸水平在ALT升高个体中也较高（无论肥胖状态如何），但校正多重检验后差异失去显著性。

粪便SCFA与代谢和膳食参数的相关性

总SCFA、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸粪便浓度与BMI呈正相关（p<0.05），除乙酸外均与ALT水平呈显著正相关。尽管没有宏量营养素与个体或总SCFA显著相关，但膳食纤维摄入与总SCFA（rho=0.327；p=0.037）呈显著正相关，与乙酸（rho=0.276；p=0.08）、丙酸（rho=0.283；p=0.073）和丁酸（rho=0.277；p=0.08）呈边界显著相关。总SCFA、丙酸和丁酸浓度也与血清葡萄糖水平呈正相关（rho分别为0.330、0.353和0.373，p<0.05；图3），但所有相关性在校正多重检验后失去显著性。

按性别和T2D状态分层的SCFA差异

按性别或T2D状态分层的粪便SCFA浓度无显著差异。由于Ob-N ALT组中女性比例较高（91.7%），我们仅比较了四组中无T2D女性的粪便SCFA水平。校正多重比较后，Ob-E ALT女性的总SCFA、乙酸、丙酸和丁酸浓度显著高于Nw-N ALT女性（p<0.05）。

肝脏脂肪变性中的肠道菌群

Nw-E ALT、Ob-N ALT和Ob-E ALT组的Alpha多样性指数（观测ASV和Shannon）均低于Nw-N ALT对照组，但仅Nw-N ALT与Ob-E ALT之间的差异在校正多重比较后显著（p<0.05）。非加权UniFrac基于的Beta多样性分析也显示仅Ob-E ALT与Nw-N ALT对照组之间存在显著差异。

Ob-N ALT个体的Roseburia、Ruminococcus-gnavus和Ruminococcus-torques属丰度显著增加，而Ob-E ALT组仅Roseburia丰度显著高于Nw-N ALT组。正常ALT与升高ALT组之间（Nw-E ALT与Nw-N ALT以及Ob-E ALT与Ob-N ALT）的细菌丰度无显著差异。在整个样本中测试这三种细菌的丰度与粪便SCFA的相关性，发现仅Roseburia（在Ob-N ALT和Ob-E ALT中更丰富）与粪便丙酸呈显著正相关（p=0.02），与乙酸（p=0.05）和丁酸（p=0.07）呈类似趋势（图4），但这些相关性在校正多重检验后失去显著性。

讨论

尽管SCFA的代谢效应已被广泛描述，但它们在肥胖和肝病中的作用仍存在争议。本研究中，无论转氨酶水平如何，肥胖受试者的粪便SCFA浓度均较高，与多项先前研究一致。有趣的是，同时存在肥胖和ALT升高的个体具有最高的乙酸、丙酸、丁酸和戊酸粪便浓度，尽管仅在与无ALT升高的正常体重个体比较时差异显著。

尽管本研究测量的是粪便而非循环中的SCFA浓度，但已有研究报告肝脂肪变性患者的丙酸和戊酸血浆浓度较高，且丁酸血浆浓度与纤维化严重程度显著相关。然而，这些发现与证明丁酸和丙酸等特定SCFA具有代谢健康益处的研究不一致。粪便中排泄的SCFA浓度是菌群SCFA产生和宿主吸收的共同结果，未来同时测量粪便、门脉和体循环中SCFA的研究有助于澄清这些不一致。

多项研究表明，SCFA通过肠-肝轴参与调节肝脏脂肪变性和炎症通路，其作用并非总是有益的。SCFA浓度升高可通过激活G蛋白偶联受体刺激肽YY分泌，抑制肠道蠕动，从而增加SCFA和其他营养素的吸收，导致肝脏脂质积累。此外，粪便丙酸和乙酸浓度与外周血中炎症相关的Th17/Treg比率呈正相关，且在NAFLD患者中该比率升高。

肥胖和NAFLD个体粪便和循环SCFA水平升高可能是由于SCFA产生菌的丰度增加。本研究中，Ob-E ALT、Ob-N ALT和Nw-E ALT个体的肠道菌群Alpha多样性低于Nw-N ALT对照组，这是肥胖和NAFLD受试者中常见的生态失调迹象。值得注意的是，肥胖且ALT正常个体的Roseburia、Ruminococcus-gnavus group和Ruminococcus-torques group（均为已知的SCFA产生菌）丰度增加，但仅Ob-E ALT组的Roseburia丰度增加。尽管Roseburia通常与代谢益处相关，但该菌属在墨西哥肥胖、代谢综合征或糖尿病成人和儿童中的丰度 consistently 较高。本研究中，Roseburia丰度与较高的丙酸粪便浓度相关。尽管实验和基因组证据表明丁酸是Roseburia的主要发酵产物，但某些物种具有产生乙酸和丙酸的基因，因此需要进行宏基因组学研究以识别与肥胖和相关代谢疾病相关的Roseburia物种。

研究局限性

本研究存在一些局限性。首先，虽然肝脏超声研究确认了肝脏脂肪变性的存在与否，但无法确定炎症或纤维化的存在。由于SCFA粪便浓度在肝纤维化患者中较高，这可能成为本研究中的混杂因素。其次，尽管使用了在墨西哥人群中验证的FFQ评估习惯性饮食，但该工具可能高估某些营养素（包括纤维）的摄入量。此外，虽然评估了已知改变SCFA粪便浓度的因素（如饮食和SCFA产生菌丰度），但未评估其他因素如肠道传输时间和/或菌群对SCFA的消耗。最后，本初步研究样本量较小，可能解释了SCFA水平与T2D状态和性别缺乏关联，以及无法明确SCFA粪便水平与肥胖和ALT升高之间关联的独立性。

结论

本初步研究表明，肥胖和血清ALT持续升高同时存在与粪便SCFA水平及SCFA产生菌（特别是Roseburia）丰度增加相关。此外，尽管粪便SCFA浓度增加与较高的膳食纤维摄入和Roseburia丰度相关，但仍需在更大样本中同时测量粪便和循环SCFA浓度的未来研究来澄清SCFA在代谢疾病中的作用。