驴皮源胶原肽YYTSASGDEMVSLK通过激活TGFβ-SMAD通路调控胶原再生抑制皮肤光老化的机制研究

本研究针对紫外线（UV）辐射导致皮肤光老化过程中胶原合成与降解失衡的核心问题，首次系统阐明了传统中药驴皮胶（CCA）及其核心活性肽YYTSASGDEMVSLK通过激活TGFβ-SMAD信号通路、调控MMPs/TIMPs平衡，双向调节胶原代谢的作用机制。研究人员通过建立动物光老化模型和细胞模型，结合分子对接（AlphaFold3）和超高分辨率成像（STEDYCON）技术，证实YYTSASGDEMVSLK可特异性结合TGFBR1/TGFBR2受体，促进胶原再生，为天然产物抗光老化提供了新的治疗策略和理论依据。

　　

随着环境污染加剧和臭氧层破坏，紫外线辐射已成为导致皮肤老化的最主要外部因素。研究表明，高达80%的面部皮肤老化可归因于光老化现象。当皮肤长期暴露于紫外线辐射后，会出现皱纹增生、色素沉着、皮肤粗糙松弛等典型特征，这不仅影响美观，更可能导致皮肤癌等严重疾病，给患者和社会带来沉重负担。紫外线中的UVA（320-400 nm）能穿透至真皮层，直接破坏弹性纤维和胶原纤维，同时诱导活性氧（ROS）产生，加剧真皮纤维结构的破坏；而UVB（280-320 nm）主要被表皮吸收，引起DNA断裂，触发炎症因子和氧化应激分子的释放，最终导致皮肤炎症和组织损伤。

目前抗光老化主要依靠物理防晒、外用维A酸或抗氧化药物以及医疗美容治疗等方法，但这些方法在稳定性和安全性方面仍存在局限。近年来，从各种动植物蛋白中提取的多肽因其优异的生物活性、高特异性和低耐药性等特点，显示出修复或激活生物功能、改善光老化皮肤的潜力。胶原作为真皮细胞外基质（ECM）的主要成分，占皮肤干重的70%，它为皮肤提供结构支撑，维持皮肤弹性和紧致度。在皮肤光老化过程中，紫外线辐射扰乱多个分子信号通路，破坏真皮层胶原纤维产生与降解间的动态平衡，导致胶原含量减少，从而引发皱纹、松弛和皮肤粗糙等问题。

驴皮胶（Colla Corii Asini, CCA）作为一种传统高级中药，在中国广泛应用于贫血、慢性疲劳综合征和免疫相关疾病的治疗。近年来，CCA的研究已扩展到抗衰老和皮肤护理领域。CCA主要成分包括蛋白质、多肽和氨基酸，富含I型和III型胶原。口服CCA可提供丰富的胶原肽和羟脯氨酸，直接补充胶原或刺激成纤维细胞增殖和胶原分泌，从而改善光老化皮肤。然而，尽管CCA具有多靶点、多途径的药理作用和缓解光老化的显著潜力，其具体作用机制和许多活性成分仍不明确。

为深入探究CCA的抗光老化机制，研究人员开展了一系列创新性研究。首先通过zenoSWATH质谱技术鉴定出CCA中的98种蛋白质和176个肽段，利用生物信息学分析发现这些肽段主要参与染色体凝集、组蛋白修饰、蛋白质折叠和翻译调控等生物学过程。随后建立UV诱导的光老化小鼠模型，通过体内光学成像和离体分析评估CCA的治疗效果。研究采用C-CUBE 3D成像系统记录皮肤外观变化，光学相干断层扫描（OCT）和HE染色分析皮肤结构，二次谐波成像（SHG）结合MATLAB分析胶原结构，Masson染色评估胶原含量，并检测氧化应激标志物（SOD、MDA）和炎症因子表达。

在细胞层面，研究采用人皮肤成纤维细胞（BJ细胞）和人角质形成细胞（HaCaT细胞）建立光老化模型，通过CCK8法检测细胞活力，DCFH-DA法测定细胞内ROS水平，SA-β-gal染色评估细胞衰老，免疫组化（IHC）和Western blot（WB）分析蛋白表达，qRT-PCR检测基因表达，并建立细胞共培养体系研究表皮细胞与成纤维细胞间的旁分泌作用。此外，研究还利用AlphaFold3平台预测肽段三维结构，通过免疫荧光（IF）和超分辨率显微镜（STEDYCON）观察肽段与受体的共定位情况。

研究结果显示，CCA显著改善了光老化皮肤的结构和外观，减少氧化应激和炎症反应，提高胶原含量和密度。质谱分析鉴定出98个与蛋白质合成密切相关的肽段。机制上，CCA通过激活TGFβ-SMAD信号通路，增加胶原合成，减少衰老标志物表达，平衡MMPs和TIMPs的表达。特别重要的是，这种效应主要与核心CCA肽YYTSASGDEMVSLK结合并上调TGFBR1和TGFBR2表达有关，从而激活TGFβ-SMAD通路，促进胶原再生。

图1展示了CCA肽段的功能预测结果。SDS-PAGE分析显示CCA样品无明显条带（图1A），表明在煮沸过程中大分子可能转化为生物活性肽。Metascape富集分析表明CCA衍生肽主要参与前期染色体凝集、核小体组装和新CENPA-containing核小体在着丝粒沉积等生物学过程（图1B）。GO分析显示这些肽段参与ATP代谢过程、端粒维持调节、糖酵解、翻译正调控和蛋白质重折叠等过程（图1C、1D）。PPI网络分析识别出10个高密度模块，对应端粒维持调节、糖酵解过程、肌质网钙离子转运、翻译正调控和染色质重塑等生物学过程（图1E、1F）。

图2展示了CCA对光老化小鼠皮肤表型的改善作用。动物实验示意图显示研究设计（图2A）。相机和C-CUBE 3D成像系统拍摄的小鼠背部皮肤图像显示，模型组在9周时出现明显皱纹和粗糙度增加，而CCA干预显著改善了这些现象，效果与VC组相当（图2B、2C）。OCT成像显示皮肤结构，定量分析表明CCA显著减少了表皮厚度，并随时间推移效果增强（图2D、2E）。HE染色显示CCA处理9周后，表皮和真皮厚度均有显著改善（图2E）。

图3展示了CCA对真皮胶原含量的保护作用。SHG成像和MATLAB分析显示，UV照射后模型组总灰度值在9周时显著降低，表明胶原纤维连续性降低。CCA处理后灰度分布明显右移，表明胶原纤维密度和数量增加（图3A、3B）。Masson染色进一步证实，模型组胶原分布松散、间隙大、纤维断裂明显，而CCA组显著改善了胶原纤维形态和结构（图3C）。

图4展示了CCA对氧化应激、炎症和衰老标志物的调节作用。氧化应激损伤分析显示，CCA处理9周后显著增加SOD活性并抑制MDA水平（图4A）。α-SMA免疫组化染色显示CCA抑制了肌成纤维细胞表型转化（图4B）。RT-qPCR分析表明CCA下调促炎细胞因子（IL-1α、IL-1β、TNF-α）并上调抗炎细胞因子IL-10表达（图4C）。衰老标志物分析显示CCA降低P16、P21和P53表达（图4D）。WB分析证实CCA促进Collagen I表达并抑制P16和P21蛋白水平（图4E）。

图5展示了CCA通过TGFβ-SMAD/MMPs通路调节胶原代谢的机制。RT-qPCR和WB分析显示，CCA上调TGFBR2、TGFBR1、SMAD2、SMAD3和SMAD4的基因和蛋白表达（图5A-D），促进SMAD2/3复合物形成和磷酸化，从而增强Collagen I合成。同时，CCA下调MMP1基因和蛋白表达，降低MMP1/TIMP1比率，抑制胶原降解。

图6展示了CCA对光老化细胞模型的保护作用。细胞实验示意图显示研究设计（图6A）。CCK8测定显示CCA提高HaCaT和BJ细胞活力（图6B）。RT-qPCR分析表明CCA降低炎症细胞因子和衰老标志物P53 mRNA表达（图6C、6D）。ROS荧光成像显示CCA减轻氧化损伤（图6D）。SA-β-gal染色显示CCA减少衰老细胞比例（图6E）。WB和RT-qPCR分析表明CCA促进Collagen I和α-SMA表达，降低P21和P53水平（图6F、6G）。

图7展示了CCA对TGFβ-SMAD/MMPs通路的调节作用。RT-qPCR和WB分析显示CCA上调TGFBR1、TGFBR2、SMAD2、SMAD3和SMAD4表达（图7A、7B），促进SMAD2/3磷酸化。MMPs表达分析显示CCA降低MMP1、MMP3、MMP10和MMP11表达（图7C、7D），抑制胶原降解。

图8展示了CCA通过MAPK14通路调节细胞间相互作用的机制。实验示意图显示研究设计（图8A）。RT-qPCR和WB分析表明，UV照射的HaCaT上清液（SN）通过旁分泌信号作用于成纤维细胞，增加MMPs/TIMPs比率，上调衰老标志物P16和P53表达，降低Collagen I表达（图8B-D）。CCA干预逆转这些效应，通过抑制MAPK14通路降低MMPs表达。

图9展示了核心CCA肽段的药理活性和作用机制。肽段实验示意图显示研究设计（图9A）。PPI分析显示CCA肽段与TGFβ-SMAD通路相互作用，AlphaFold3预测了YYTSASGDEMVSLK和HFSVEGQLEFR的结构（图9B）。药理学验证显示YYTSASGDEMVSLK显著促进Collagen I mRNA表达（图9C），增加I型和III型胶原蛋白水平，降低衰老蛋白P16和P21（图9D）。YYTSASGDEMVSLK上调TGFBR1和TGFBR2基因和蛋白表达（图9E、9F），激活TGFβ-SMAD通路。AlphaFold3预测YYTSASGDEMVSLK与TGFBR1/TGFBR2的相互作用（图9G）。WB和STEDYCON成像证实YYTSASGDEMVSLK与TGFBR1和TGFBR2共定位（图9H、9I）。

研究结论表明，CCA及其活性成分（特别是肽段YYTSASGDEMVSLK）通过激活TGFβ-SMAD信号通路、调节MMPs/TIMPs平衡，双向调控胶原合成与降解过程，有效缓解紫外线诱导的皮肤光老化。该研究不仅阐明了CCA抗光老化的物质基础和分子机制，为传统中药的现代化应用提供了科学依据，也为开发针对皮肤光老化的多靶点治疗策略提供了新思路。

研究的创新点在于首次系统鉴定出CCA中的活性肽段，并阐明其通过特异性结合TGFBR1/TGFBR2受体激活下游信号通路的分子机制。同时，研究采用多种先进技术手段，包括体内光学成像、超高分辨率显微镜和分子对接预测等，为天然产物抗光老化研究提供了新的方法学参考。

然而，研究也存在一定局限性，如CCA肽段与靶标结合后的修饰和激活机制尚需进一步探究。此外，研究主要聚焦于胶原代谢调节，对CCA在其他皮肤生物学过程（如屏障功能、免疫调节等）中的作用尚未深入探讨。未来研究可进一步拓展CCA在多维度皮肤健康维护中的作用机制，为其综合开发利用提供更全面的科学依据。

总体而言，本研究证实了CCA在延缓UV诱导皮肤老化方面的药理作用和机制，拓展了其作为抗光老化剂的开发潜力，为传统中药在现代皮肤医学中的应用奠定了重要基础。