欧亚狼（Canis lupus lupus）中肉孢子虫属（Sarcocystis spp.）的高感染率：第三代测序技术揭示了混合感染情况

《International Journal for Parasitology: Parasites and Wildlife》：High prevalence of Sarcocystis spp. in the Eurasian wolf ( Canis lupus lupus): Third-generation sequencing resolves mixed infections

瑞士自由放养狼群中 sarcocystis 感染的分子流行病学分析。通过 coprological 检测和 Third-generation sequencing（PacBio），共鉴定 9 种已知 sarcocystis 种类，首次确认欧洲狼为 sarcocystis linearis、iberica、venatoria 的自然最终宿主。研究显示 76% 狼携带该寄生虫，混合感染占 84%，NGS 技术有效区分混合感染。结果揭示了狼在传播 sarcocystis 中的关键生态角色，并验证了新型测序技术对寄生虫学研究的价值。

　　在这项研究中，科学家们关注的是瑞士自由活动的狼群中寄生虫 *Sarcocystis* 的感染情况，特别是其在不同宿主之间的传播模式。*Sarcocystis* 是一种寄生性异宿主原生动物，广泛感染多种宿主，包括哺乳动物、鸟类、爬行动物和鱼类。这种寄生虫的传播通常遵循一种捕食者-猎物循环，其中中间宿主（IH）通过摄入受污染的食物或水中的卵囊或孢子囊被感染，而最终宿主（DH）则通过食用含有寄生虫的中间宿主肌肉组织获得感染。该研究的目标是使用传统的粪便检查方法和分子生物学技术，评估瑞士自由活动的狼群中 *Sarcocystis* 感染的普遍性和物种多样性，并检验第三代测序技术在解析混合感染中的作用。

研究团队共收集了87份狼的肠道内容物样本，时间跨度为2017年至2023年。这些样本来自在瑞士进行尸检的狼，包括被发现死亡或合法捕杀的个体。通过使用44%的氯化锌溶液进行沉淀-浮选法，研究人员发现76%的样本中检测到了 *Sarcocystis* 的卵囊或孢子囊。随后，从57份阳性样本中提取DNA，并通过 *Sarcocystis 18S* rRNA 的筛查PCR检测到其中55份样本为阳性。进一步的PCR分析涉及线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因和针对 *S. cruzi* 的实时PCR。对于常规PCR的产物，研究人员进行了Sanger测序以确定物种。结果显示，16%的样本为单一感染，而84%的样本显示混合感染。

为了更准确地解析混合感染，研究团队选择了五份样本进行第三代测序（Pacific Biosciences）分析，针对 *18S* rRNA 的全长和 *COI* 基因片段。通过BLAST和系统发育分析，研究人员验证了分类学的准确性。分子分析确定了九种已知的 *Sarcocystis* 物种，包括 *S. tenella, S. arieticanis, S. capreolicanis, S. linearis, S. gracilis, S. cruzi, S. capracanis, S. iberica* 和 *S. venatoria*。这些发现首次确认了欧亚狼作为多种 *Sarcocystis* 物种的自然最终宿主。

研究还揭示了狼在寄生虫传播中的重要角色。在许多情况下，狼作为最终宿主，可能感染多种 *Sarcocystis* 物种，而这些物种在中间宿主中往往表现出较高的病理性症状。通过使用第三代测序技术，研究人员能够更精确地识别混合感染中的不同寄生虫物种，从而提高了诊断的准确性和对宿主-寄生虫关系的理解。这一研究不仅填补了关于瑞士狼群寄生虫感染的空白，也为其他地区的相关研究提供了重要的参考。

研究过程中，科学家们采用了多种方法以确保数据的准确性和全面性。首先，他们使用了传统的沉淀-浮选法来检测寄生虫的卵囊或孢子囊，随后通过分子生物学技术提取DNA并进行PCR扩增。这些方法结合了DNA提取、PCR扩增、测序和生物信息学分析。为了进一步提高分辨率，他们采用了第三代测序技术，这是一种能够提供高精度序列信息的先进技术。通过这种方法，研究人员能够更有效地解析复杂的混合感染情况，从而更准确地确定寄生虫的物种组成。

此外，研究还探讨了不同方法在检测 *Sarcocystis* 感染中的优缺点。传统的PCR-测序方法在解析混合感染时存在一定的局限性，因为它们可能无法区分形态相似的卵囊或孢子囊。而第三代测序技术，如PacBio测序，能够提供更长的读长和更高的准确性，从而显著提高物种识别的分辨率。研究人员开发了新的生物信息学流程，以适应第三代测序数据的分析需求，并通过BLAST和系统发育分析验证了分类结果。

研究结果表明，狼作为最终宿主，感染了多种 *Sarcocystis* 物种，包括一些此前在中间宿主中发现但尚未确认其最终宿主的物种。这些发现对于理解寄生虫的生态循环和宿主-寄生虫相互作用具有重要意义。同时，研究还强调了在野外宿主中，通过结合传统和分子方法进行寄生虫研究的重要性，以及第三代测序技术在解析复杂混合感染中的潜力。

总体而言，这项研究不仅提供了关于瑞士狼群寄生虫感染的详细信息，还为未来在宿主-寄生虫动态、寄生虫生命周期和分子诊断方法的发展提供了基础。通过这种综合方法，科学家们能够更全面地了解寄生虫的传播模式，并为公共卫生和野生动物管理提供重要的数据支持。