鼻喷腺病毒载体-三聚体蛋白复合疫苗：针对奥密克戎变异株的广谱高效黏膜免疫新策略

本刊推荐：为应对奥密克戎变异株的免疫逃逸和现有疫苗无法阻断病毒传播的挑战，研究人员开发了新型鼻喷双组分疫苗（Ad5XBB.1.5+RBDXBB.1.5-HR）。该疫苗通过腺病毒载体激活STING信号通路增强黏膜免疫，在小鼠和仓鼠模型中证明可有效抑制病毒复制和传播，人体试验显示良好安全性和显著免疫应答，为新冠肺炎黏膜疫苗研发提供了创新平台。

　　

在全球抗击新冠疫情的过程中，奥密克戎（Omicron）变异株及其不断演化的亚型（如XBB.1.5、XBB.1.16等）展现出显著的免疫逃逸能力，给疫苗研发带来巨大挑战。虽然现有肌肉注射疫苗对预防重症和死亡有效，但它们难以在呼吸道黏膜诱导有效的免疫应答，无法彻底阻止病毒复制和传播。这导致即使接种疫苗，仍可能出现无症状感染和病毒传播。因此，研发能诱导黏膜免疫的鼻喷疫苗成为下一代新冠疫苗的重要方向。

然而，鼻喷疫苗的研发面临诸多难题：多数处于临床研究的候选疫苗（包括腺病毒载体疫苗、减毒活病毒疫苗等）免疫效果有限，且缺乏针对当前流行变异株的广谱保护力；蛋白亚单位疫苗虽安全易生产，但免疫原性弱，需要安全有效的佐剂；目前尚无世界卫生组织批准全球使用的鼻喷新冠疫苗。

在此背景下，研究人员在《Nature Biomedical Engineering》发表最新研究成果，开发了一种创新性的双组分鼻喷疫苗策略，将表达XBB.1.5刺突蛋白的腺病毒载体（Ad5_XBB.1.5）与自组装三聚体重组蛋白（RBD_XBB.1.5-HR）相结合，在小鼠、仓鼠和人体中证明了其卓越的免疫原性和保护效果。

本研究主要采用以下关键技术方法：通过分子克隆技术构建表达XBB.1.5和BA.5全长刺突蛋白的复制缺陷型腺病毒载体；使用杆状病毒-昆虫细胞系统表达并纯化三聚体RBD-HR蛋白；利用动态光散射等技术表征疫苗制剂稳定性；通过ELISA、假病毒和真病毒中和实验评估体液免疫；采用流式细胞术分析黏膜和组织中T细胞应答；应用单细胞RNA测序解析免疫机制；使用hACE2转基因小鼠和叙利亚金黄仓鼠模型进行攻毒和病毒传播实验；开展70人规模的临床研究者发起试验（IIT）评估安全性和免疫原性。

The two-component intranasal vaccine elicits stronger humoral immunity

研究人员首先构建了表达XBB.1.5全长刺突蛋白的腺病毒载体（Ad5_XBB.1.5）和源自XBB.1.5受体结合域（RBD）的三聚体蛋白（RBD_XBB.1.5-HR），并优化了二者混合制备双组分疫苗的工艺。小鼠实验表明，单独使用RBD_XBB.1.5-HR蛋白几乎不诱导血清IgG抗体，而Ad5_XBB.1.5单独使用可诱导持续抗体反应。两者联合则显著提高血清中RBD特异性IgG抗体滴度，并在呼吸道（支气管肺泡灌洗液和鼻腔灌洗液）中诱导更高水平的IgG和IgA。假病毒中和实验显示，双组分疫苗对原型株、Delta和多种奥密克戎亚型（BA.2.75、BA.4/5、BF.7、BQ.1、BQ.1.1、XBB、XBB.1.5和XBB.1.16）的中和能力显著增强，高通量中和抗体几何平均滴度（GMT）提高1.3-23.4倍。真病毒中和实验进一步证实了其对活病毒（BA.2、BA.5.2.48和XBB.1.16）的交叉中和活性。

The two-component vaccine induces superior airway cellular immunity

除了体液免疫，研究人员还评估了细胞免疫应答。双组分疫苗显著增加了支气管肺泡灌洗液中抗原经验性CD8⁺组织驻留记忆T细胞（T_RM，表型为CD44⁺CD69⁺CD103⁺）频率，而非CD4⁺ T_RM细胞。酶联免疫斑点（ELISpot）显示，双组分疫苗接种后肺泡灌洗液中IFN-γ斑点形成细胞最多。肺组织细胞内细胞因子染色（ICS）表明，双组分疫苗增加了刺突蛋白特异性IFN-γ和TNF分泌记忆T细胞数量。此外，纵隔淋巴结中滤泡辅助性T细胞（T_fh，CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺）和RBD特异性生发中心B细胞（GC B，CD19⁺GL-7⁺CD95⁺）频率也最高，脾细胞中抗原特异性细胞免疫反应同样增强。

The STING pathway is critical for the adenovirus-vector adjuvant effect

为探究腺病毒载体增强蛋白免疫原性的机制，研究人员在多种基因敲除小鼠（Tlr2^-/-、Tlr9^-/-、Myd88^-/-、Nlrp3^-/-、Casp1^-/-、Il1b^-/-、Sting^-/-和Cd8a^-/-）中评估双组分疫苗（Ad5_BA.5+RBD_BA.5-HR）的免疫效果。结果显示，在Sting^-/-小鼠中，腺病毒的佐剂效应完全消失，血清IgG和肺泡IgA抗体滴度无显著改善，CD8⁺ T_RM细胞增加、抗原特异性CD8⁺和CD4⁺记忆T细胞增强效应均被废除。单细胞RNA测序发现，STING编码基因Tmem173在树突状细胞（DC，包括CCR7⁺ DC、DC1和浆细胞样DC）中富集，且双组分疫苗接种后其表达上调。STING通路关键基因（Adar、Ccl5、Ddx41等）在DC群体中显著激活，抗原加工提呈相关基因表达也明显上调。腺病毒载体（包括Ad5_Empty和Ad5_XBB.1.5）可促进DC对荧光标记RBD_XBB.1.5-HR蛋白的吞噬。

The three-component vaccine as a heterologous booster to improve immunity

为扩展疫苗广谱性，研究人员开发了三组分疫苗（Ad5_XBB.1.5+RBD_XBB.1.5-HR+RBD_BA.5-HR），发现其诱导的血清和呼吸道结合抗体更高，对奥密克戎亚型的中和能力进一步增强，且不削弱对XBB谱系的中和。三组分疫苗也增强了呼吸道T_RM细胞和肺中IFN-γ分泌CD8⁺ T细胞频率，以及纵隔淋巴结中T_fh和GC B细胞数量。在预先用三剂Delta靶向mRNA疫苗免疫的小鼠中，两剂三组分疫苗鼻喷加强显著提高了血清中和抗体滴度（对BA.5、BF.7、BQ.1等提高11.8-20.5倍），并诱导了呼吸道黏膜免疫（IgA、IgG、T_RM细胞等）。

The two-component vaccine protects against viral infection and transmission

攻毒实验显示，双组分疫苗（Ad5_XBB.1.5+RBD_XBB.1.5-HR）免疫的小鼠在XBB.1.16活病毒攻击后，咽喉拭子病毒载量最低（第4天几乎检测不到基因组RNA），呼吸道组织（鼻甲、气管和肺）中病毒基因组RNA和亚基因组RNA（活性复制指标）显著减少或完全检测不到，肺病理变化轻微。在"接触/空气传播"仓鼠模型中，双组分疫苗有效阻断了XBB.1.5病毒从感染供体动物向接种动物的传播，受体动物咽喉拭子和呼吸道组织病毒载量最低，所有样本均未检测到亚基因组RNA。

The two-component vaccine improves systemic and mucosal immunity in humans

最后，研究人员开展了一项70人参与的临床IIT试验。参与者既往接种2-3剂新冠疫苗（主要为灭活疫苗），多数感染过BA.5。他们接受两剂双组分疫苗（低剂量：1×10¹⁰病毒颗粒+20μg蛋白；高剂量：2×10¹⁰病毒颗粒+40μg蛋白）鼻喷免疫。结果显示，疫苗安全性良好，最常见不良反应为轻度鼻塞、咽痛、鼻分泌物和头痛（总发生率7.14%），无三级及以上不良反应。免疫后，鼻洗液中RBD特异性IgA抗体滴度显著增加（首剂后107倍，次剂后203倍），对原型株、XBB.1.5和XBB.1.16假病毒中和活性分别提高5.83-13.50倍、20.05-49.50倍和9.00-18.75倍。血清中和抗体对多种XBB亚型（XBB.1.5、XBB.1.6、XBB.1.16等）的GMT达515-801，真病毒中和实验也证实了其对祖先株、XBB.1.5和XBB.1.16的有效中和。

本研究成功开发了一种新型双组分鼻喷疫苗平台，通过腺病毒载体和蛋白抗原的协同作用，在呼吸道黏膜诱导了强大的体液和细胞免疫，有效应对了奥密克戎变异株的免疫逃逸问题。机制上，腺病毒载体通过激活DC中STING信号通路发挥佐剂效应，增强抗原提呈和免疫应答。该疫苗在小鼠、仓鼠和人体中均表现出良好安全性和免疫原性，能有效抑制病毒复制和阻断传播。尤其重要的是，该策略可采用模块化设计，通过调整组分比例开发多价疫苗应对共循环变异株。研究为新冠肺炎黏膜疫苗研发提供了新思路，对未来呼吸道传染病疫苗设计具有重要借鉴意义。