双金属有机框架与没食子酸整合3D打印支架：通过免疫-血管-神经协同作用革新难治性骨缺损修复

针对类固醇相关性骨坏死（SAON）骨缺损的免疫失衡、血管生成受阻和神经支配不足等多维微环境失调问题，研究人员开发了PLA/GA/MgCu-MOF复合支架。该支架通过Mg2+/Cu2+双离子协同和没食子酸（GA）的整合，实现了抗氧化、促血管生成、神经再生和成骨分化的多重调控，显著促进了大鼠SAON骨缺损的修复，为难治性骨缺损治疗提供了创新策略。

　　

长期使用糖皮质激素导致的骨坏死是骨科常见的难治性疾病，其引发的骨缺损由于多重细胞功能失调和微环境破坏而难以修复。尽管在调控免疫反应和促进血管化方面已取得进展，但有效的神经支配策略仍然缺乏。值得注意的是，免疫反应、血管生成和神经支配是相互依赖的过程，共同调控骨再生。因此，开发一种能够协同调控免疫、血管和神经微环境的生物材料成为治疗SAON相关骨缺损的关键。

在这项发表于《Materials Today Bio》的研究中，作者团队设计了一种新型3D打印复合支架，通过整合镁-铜双金属有机框架（MgCu-MOF74）、没食子酸（GA）和聚乳酸（PLA），构建了具有高度互联孔隙结构和多重生物活性的支架系统。该支架不仅具备优异的机械性能和降解特性，还能通过GA和双离子协同作用实现多细胞调控，包括促进巨噬细胞M2极化、诱导内皮细胞介导的血管生成、刺激雪旺细胞形态成熟以及增强骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化，同时显著增强细胞间通讯，优化局部多维微环境。

研究采用的主要关键技术方法包括：通过一步水热法合成水稳定性双金属有机框架MgCu-MOF74；利用3D打印技术制备PLA/GA/MgCu-MOF多孔复合支架；通过RNA测序分析GA对神经再生的作用机制；使用大鼠SAON模型进行体内修复效果评估；采用免疫荧光染色、Western blot、qRT-PCR等多种分子生物学技术检测细胞行为和信号通路变化。

2.1. GA对神经发生的影响

通过RNA测序发现，GA处理显著上调了神经发生相关基因（Sema3a、Notch4、NGF、Slit3）的表达，并激活MAPK信号通路。Western blot证实GA提高了MEK和ERK的磷酸化水平，qRT-PCR显示GA上调了S100、MBP、PMP22、NGF和P0等神经相关基因的表达，表明GA通过激活MAPK/ERK信号通路调控神经元活动和轴突生长。

2.2. MgCu-MOF74的合成与表征

成功合成了不同Cu掺杂比例的MgCu-MOF74。随着Cu含量增加，晶体形态由盘状转变为棒状，且粒径增大。XPS分析证实Cu以混合价态（Cu⁺/Cu²⁺）存在，XRD显示特征峰向低角度移动。离子释放实验表明，MgCu-MOF74可实现Mg²⁺和Cu²⁺的缓慢持续释放，避免了爆发释放带来的毒性。

2.3. MgCu-MOF74的抗氧化能力

DPPH自由基清除实验显示，MgCu2和MgCu3具有较高的自由基清除率。细胞内ROS检测表明，MgCu-MOF74能显著降低氧化应激下的ROS水平，其抗氧化机制归因于Cu²⁺/Cu⁺的快速氧化还原循环以及Mg²⁺对抗氧化酶系统的上调。

2.4. MgCu-MOF74对BMSCs增殖和成骨分化的影响

细胞毒性实验表明，MgCu3组因Cu离子释放过高而降低细胞存活率，Mg-MOF74、MgCu1和MgCu2组则表现出良好的生物相容性。ALP和茜素红染色显示，MOF处理组显著促进早期成骨分化和矿化结节形成。qRT-PCR分析发现，Runx2、Col-I、OCN和ALP等成骨基因显著上调。

2.5. MgCu-MOF74的血管生成特性

活死染色、迁移实验和试管形成实验表明，MgCu-MOF74能显著促进HUVECs的增殖、迁移和血管生成，且效果随Cu含量增加而增强。qRT-PCR显示CD31和VEGF基因表达上调，其中MgCu2表现出最显著的促血管生成潜力。

2.6. 3D打印多孔复合支架的制备与表征

SEM显示PLA/GA/MgCu-MOF支架表面更粗糙，孔隙均匀且互联（419±24μm）。力学测试表明，PLA/GA/MgCu-MOF支架的压缩模量和强度显著高于其他组。接触角测试显示PLA/GA/MgCu-MOF具有适度的亲水性（52.19°），有利于细胞粘附。

2.7. 体外降解行为

降解实验表明，PLA/GA/MgCu-MOF支架在2个月后质量损失达8.87%，显著高于PLA和PLA/GA组。GA的释放初期较快后减缓，而Mg²⁺和Cu²⁺的释放逐渐加速，降解后溶液pH升高至7.59。

2.8. PLA/GA/MgCu-MOF的体外生物相容性

活死染色和CCK-8 assay显示，PLA/GA/MgCu-MOF支架支持BMSCs的高密度粘附和增殖，细胞形态呈纺锤形且细胞间连接紧密，表明其优异的生物相容性。

2.9. PLA/GA/MgCu-MOF的抗炎作用研究

在H₂O₂诱导的氧化应激模型中，PLA/GA/MgCu-MOF支架显著降低细胞死亡和细胞内ROS水平。RAW264.7细胞实验显示，该支架促进M2巨噬细胞极化（CD206表达升高），抑制M1表型（iNOS表达降低），并调节炎症因子分泌（IL-4、IL-10升高，TNF-α、IL-6降低）。

2.10. PLA/GA/MgCu-MOF的血管生成作用研究

HUVECs在PLA/GA/MgCu-MOF支架上表现出更高的增殖、迁移和试管形成能力。Western blot证实VEGF和CD31蛋白表达上调，表明该支架通过激活相关信号通路促进血管生成。

2.11. PLA/GA/MgCu-MOF的神经发生作用研究

RSC-96细胞在PLA/GA/MgCu-MOF支架上呈现纺锤形态、轴突伸长和紧密连接。免疫荧光显示S100和NF-200表达升高，qRT-PCR证实MBP、PMP22和P0基因上调。ELISA检测表明NGF和BDNF分泌增加，说明该支架优化了神经再生微环境。

2.12. PLA/GA/MgCu-MOF的成骨分化作用研究

ALP和茜素红染色显示，PLA/GA/MgCu-MOF组BMSCs的早期成骨分化和矿化结节形成显著增强。Western blot和qRT-PCR证实Runx2、Col-I、OCN和ALP表达上调，表明成骨分化能力提升。

2.13. PLA/GA/MgCu-MOF的成骨机制

转录组测序发现，PLA/GA/MgCu-MOF支架上调氧化磷酸化和PI3K-Akt信号通路相关基因。Western blot显示PI3K、AKT磷酸化水平以及NDUFS5、UQCR10、COX6C表达增加。JC-1染色和ATP测定证实该支架恢复线粒体膜电位和能量代谢，减轻氧化应激损伤。

2.14. PLA/GA/MgCu-MOF对细胞间通讯的调控

通过条件培养基间接共培养实验，发现PLA/GA/MgCu-MOF处理的细胞分泌物能显著促进HUVECs血管生成、RSC-96神经成熟和BMSCs成骨分化，表明该支架通过增强细胞间通讯优化微环境。

2.15. PLA/GA/MgCu-MOF的体内免疫调节、血管生成、神经发生和成骨作用

大鼠SAON模型体内实验显示，PLA/GA/MgCu-MOF支架植入后7天促进M2巨噬细胞极化（Arg-1表达升高，iNOS降低），调节炎症因子表达（TGF-β、IL-10升高，IL-6、TNF-α降低）。微CT和免疫荧光证实该支架显著增强血管生成（CD31、VEGF表达升高）、神经支配（CGRP表达增加）和骨再生（OCN表达升高、骨密度和骨体积增加）。组织学染色和qPCR分析进一步验证了其促进神经发生和成骨分化的效果。

研究结论表明，PLA/GA/MgCu-MOF支架通过GA和双离子协同作用，协同调控免疫、血管和神经微环境，有效缓解骨坏死微环境并促进骨再生。机制上，该支架调节氧化磷酸化、上调抗氧化基因表达以恢复线粒体功能，引导巨噬细胞向抗炎表型极化，并通过激活MAPK/ERK和PI3K-Akt信号通路进一步刺激神经发生、诱导血管生成和增强成骨分化。体内实验证实该支架显著加速SAON相关骨缺损的修复，为难治性骨缺损治疗提供了有前景的策略。