基于重组病毒蛋白VP2的传染性法氏囊病病毒抗体检测ELISA方法的开发与评价

本研究针对家禽养殖中传染性法氏囊病病毒（IBDV）抗体监测需求，开发了一种以重组His-VP2蛋白为包被抗原的间接ELISA方法。该方法通过高效表达和简易纯化策略获得抗原，验证显示其灵敏度（99%）、特异性（98%）与商业试剂盒高度一致，为低成本、本土化监测IBDV免疫状态提供了可靠技术方案。

　　

传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus, IBDV）是引起鸡群高度传染性和免疫抑制性疾病的主要病原体，对全球家禽业造成显著经济损失。该病毒主要攻击幼禽的法氏囊（Bursa of Fabricius），破坏未成熟的B淋巴细胞，导致免疫抑制状态，使鸡群对疫苗应答效率降低且易受机会性病原体感染。在阿根廷等家禽生产大国，养殖场需频繁监测血清抗体水平以评估疫苗效果和感染状态，但现有商业化ELISA检测试剂盒完全依赖进口，成本高昂且供应受限。因此，开发本土化、低成本且高效的IBDV抗体检测技术具有重要实践意义。

为解决这一问题，阿根廷国家科学技术研究委员会（CONICET）的Leticia Keller团队在《Revista Argentina de Microbiología》发表研究，成功开发了一种基于重组病毒蛋白VP2的间接ELISA方法（VP2-ELISA）。该研究利用大肠杆菌表达系统高效生产重组His-VP2融合蛋白，并通过简易包涵体纯化工艺获得高纯度抗原，避免了昂贵的色谱纯化步骤。所建立的检测方法在灵敏度、特异性和重复性方面均与市售IDEXX ELISA试剂盒高度一致，为本土化监测鸡群IBDV抗体水平提供了可靠替代方案。

关键技术方法包括：从疫苗株（Cevac?Transmune）克隆IBDV VP2基因，构建pRSET-VP2原核表达载体；通过IPTG诱导大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达重组His-VP2蛋白；采用超声破碎、去垢剂处理和离心步骤纯化包涵体；使用已知浓度BSA进行蛋白定量；通过棋盘滴定法优化ELISA反应条件（抗原包被量1.2 μg/孔，血清稀释度1:500，酶标二抗稀释度1:10,000）；采用IDEXX商业化试剂盒作为参考标准，使用406份鸡血清样本（含126份阴性样本和280份阳性样本）进行方法验证；通过变异系数（CV）评估批内和批间重复性。

表达与纯化重组His-VP2蛋白

研究人员首先克隆了IBDV Winterfield 2512株的成熟VP2基因（1338 bp），将其插入pRSET-A载体，构建表达His标签融合蛋白的重组质粒。转化大肠杆菌后经IPTG诱导，SDS-PAGE和Western Blot分析证实约52 kDa的重组蛋白在诱导90分钟后高效表达（图1A-B）。该蛋白主要存在于包涵体中（图1C），通过超声破碎、 Triton X-100和脱氧胆酸钠处理结合离心纯化，获得高纯度蛋白，每升培养物产量达32.4 mg（图1D）。值得注意的是，纯化后的包涵体中未观察到降解条带或杂蛋白污染。

间接VP2-ELISA的建立与优化

通过棋盘滴定实验确定最佳包被抗原浓度为1.2 μg/孔，血清和酶标二抗最佳稀释度分别为1:500和1:10,000（图2）。以126份阴性血清的OD_405nm均值加3倍标准差计算 cutoff值为0.1915。该方法对280份阳性血清和126份阴性血清的检测显示，与IDEXX试剂盒相比，相对灵敏度为99%，特异性为98%，总符合率达99%，Kappa一致性系数为0.999（表1，图3）。对其它禽病毒（如H7N7流感病毒和传染性支气管炎病毒）阳性血清的检测结果均为阴性，证明方法具有良好特异性（补充图S1）。

分析灵敏度与重复性验证

采用弱阳性血清进行稀释系列测试，显示该方法可检测最高1:1100稀释度的抗体（图4）。批内重复性实验（10次重复）的变异系数为1.67%-4.34%，批间重复性（3次重复×3天×2人操作）的变异系数为0.54%-5.39%（表2），均符合OIE推荐的ELISA验证标准（CV≤10%和≤20%）。

研究结论表明，利用大肠杆菌表达系统可低成本、规模化生产IBDV VP2重组抗原，通过简易包涵体纯化工艺即可获得适用于ELISA的高纯度蛋白，无需复杂色谱纯化。所建立的VP2-ELISA方法在准确性、特异性和重复性方面与进口商用试剂盒等效，且生产成本显著降低。该技术为阿根廷及类似地区的家禽养殖业提供了本土化抗体监测工具，有助于减少对进口试剂的依赖，提升传染病防控能力。未来可进一步优化抗原表达形式（如病毒样颗粒）并拓展到其他禽病抗体检测领域。