NR3C1介导的表观遗传调控抑制小鼠星形胶质细胞免疫反应及其在发育关键期的作用

本研究揭示了转录因子NR3C1在星形胶质细胞早期发育中的关键作用，通过多组学分析发现其通过表观遗传调控机制抑制免疫相关基因表达。研究人员发现特异性敲除星形胶质细胞NR3C1的小鼠在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中表现出加重的免疫反应，证明NR3C1在发育关键期建立的表观遗传记忆对成年期免疫稳态维持具有重要意义。

　　

在神经科学领域，星形胶质细胞作为中枢神经系统中最丰富的胶质细胞，长期以来被认为仅仅是神经元的支持细胞。然而近年来的研究发现，这些细胞在脑功能维持和疾病发生中扮演着远比想象中更为重要的角色。从维持血脑屏障完整性到调节突触可塑性，从代谢支持到免疫应答，星形胶质细胞的功能多样性令人惊叹。但令人困惑的是，尽管星形胶质细胞在多种脑疾病中都表现出异常反应，其在特定疾病中选择性易感的机制却始终是个未解之谜。

更值得深思的是，越来越多的证据表明神经发育障碍和神经退行性疾病可能与星形胶质细胞的功能失调密切相关。然而，星形胶质细胞功能障碍最初是如何产生的？发育过程中的基因调控网络又在这一过程中扮演什么角色？这些问题一直困扰着研究人员。其中一个重要瓶颈在于缺乏对星形胶质细胞发育过程中各个阶段的高精度时间分辨率表征，特别是围绕从神经发生向胶质发生转换的"胶质发生开关"时期的动态变化了解甚少。

为了解决这些挑战，韩国科学技术院的研究团队开展了一项系统性研究，其结果最近发表在《Nature Communications》上。研究人员通过对星形胶质细胞从胚胎发生到出生后成熟阶段的基因调控程序进行全面的多组学分析，揭示了转录因子NR3C1在早期出生后发育阶段的关键调控作用，并发现其在星形胶质细胞免疫应答调控中具有长期影响。

研究团队主要运用了几项关键技术：首先利用Aldh1l1-EGFP转基因小鼠模型，通过荧光激活细胞分选（FACS）技术从E16到P30多个时间点分离星形胶质细胞；接着采用RNA测序（RNA-seq）、转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）和高效染色质构象捕获技术（HiCAR）进行多组学分析；通过"活性-by-接触"（ABC）模型预测顺式调控元件（cCRE）与靶基因的调控关系；使用PageRank算法预测转录因子活性；建立星形胶质细胞特异性诱导型NR3C1条件性敲除（NR3C1 cKO）小鼠模型；应用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型进行免疫挑战实验；最后通过单核RNA测序（snRNA-seq）和染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）等技术深入解析分子机制。

精确的时间转录组分析揭示星形胶质细胞发育轨迹

研究人员首先对围产期星形胶质细胞发育过程中的动态基因调控进行了深入研究。他们使用Aldh1l1-EGFP转基因小鼠，因为ALDH1L1是在星形胶质细胞群体和发育阶段中稳定表达的公认全星形胶质细胞标志物。通过荧光激活细胞分选（FACS）从小鼠皮质组织中分离EGFP阳性星形胶质细胞。

研究团队在关键发育窗口期——从胚胎16天（E16）（放射状胶质细胞开始分化为胶质细胞时）到出生后30天（P30）（星形胶质细胞达到成熟形态时）进行了采样。他们采用RNA-seq、ATAC-seq和HiCAR来捕获整个星形胶质细胞发育过程中发生的转录组、表观基因组和远程染色质接触动态。

主成分分析（PCA）显示，转录组谱的轨迹分析很好地沿着发育阶段对齐样品，重复样本分组在一起，验证了动态转录组景观准确反映了发育进程。分析进一步将时间点分为三个主要阶段：早期（E16到E18）、中期（P1到P7）和晚期（P17到P30）。研究人员确定了4198个阶段特异性差异表达基因（DEG）。早期阶段基因如Nes、Meis2、Neurog2和Mki67表明增殖放射状胶质细胞的特征在整个胚胎发生过程中持续存在。相比之下，晚期阶段基因包括S100b、Rora和Il33，富含与免疫反应通路相关的基因本体术语，与先前报道的成熟星形胶质细胞转录组谱一致。

重要的是，胶质发生开关的关键调节因子如Nfia、Jak2和Stat3在中期高表达，突显了这个时期作为星形胶质细胞分化的关键窗口。

NR3C1是早期出生后星形胶质细胞发育的关键调节因子

高分辨率基因调控网络导致了对参与星形胶质细胞发育的关键转录因子的识别。使用整合分析，研究人员基于PageRank算法预测了每个发育阶段的转录因子活性。如预期的那样，已知的发育转录因子从胚胎发生到第一个出生后周都表现出高活性。

为了关注阶段特异性转录因子，他们选择了在发育阶段（早期，n=26；中期，n=16；晚期，n=13）方面在转录因子活性和表达水平都显示出高特异性的55个转录因子。在早期阶段，参与染色质结构和神经发生的转录因子如CTCF、YY1和NEUROD1，突出了神经发生过程中神经元多能性的维持。另一方面，与免疫反应相关的转录因子包括ETS1、FOXO1和RORA，在晚期显示出强大的活性。

值得注意的是，考虑到精确的时间分析，研究人员还能够识别在中期具有强活性的发育转录因子，包括即时早期基因（IEG）如EGR1、FOS和JUN，以及核受体如NR4A3、NR4A1和NR3C1。

为了验证单细胞分辨率下转录因子活性在每个发育阶段的特异性，研究团队分析了小鼠发育皮质的单细胞RNA-seq（scRNA-seq）数据集。他们专注于属于神经源性和星形胶质细胞谱系的细胞，通过其标志基因表达定义。对50,722个神经源性和21,944个星形胶质细胞谱系细胞的分析显示，在早期发育阶段存在共享的祖细胞，然后分化为不同的轨迹，与小鼠大脑发育的已知阶段一致。

NR3C1靶基因与免疫相关脑功能障碍相关

脑发育基因调控网络经常与各种神经系统疾病有关。为了探索NR3C1以及五个星形胶质细胞中期特异性转录因子（FOS、EGR1、JUN、JUNB和STAT3）的病理学关联，研究人员使用DisGeNET对每个转录因子的预测靶基因进行了基因集富集分析。

分析揭示了每个转录因子的靶基因与各种神经系统疾病之间的独特关联。例如，他们观察到与双相情感障碍相关的基因富集，其中雷帕霉素（mTOR）通路通过STAT3的靶基因参与。值得注意的是，NR3C1的靶基因显示出与多发性硬化症（MS）、自身免疫性疾病和阿尔茨海默病的显著关联，表明星形胶质细胞NR3C1在这些免疫相关神经系统疾病中的潜在作用。

NR3C1缺失加剧EAE诱导后的免疫反应

最近的CRISPRi筛选也报道NR3C1在调节星形胶质细胞的免疫反应中发挥作用。然而，其在早期出生后星形胶质细胞发育中的调节功能和生理作用尚不清楚。为了研究NR3C1在此背景下的潜在作用，研究人员使用Cre-lox系统生成了星形胶质细胞特异性诱导型NR3C1条件性敲除（NR3C1 cKO）小鼠，将Aldh1l1-creERT2小鼠与loxP-flanked Nr3c1（Nr3c1^fl/fl）小鼠杂交。

在分娩当天，皮下注射4-羟基他莫昔芬（4-OHT）以在其估计的活跃阶段约P7-P17之前诱导NR3C1缺失。NR3C1 cKO小鼠在P17时显示NR3C1阳性星形胶质细胞数量显著减少。此外，他们观察到从P5开始NR3C1阳性星形胶质细胞显著减少，并且这种减少直到P53保持一致。

在确认敲除效率后，研究人员使用从P17的Cre对照和NR3C1 cKO小鼠分离的星形胶质细胞进行了RNA-seq。Cre对照和NR3C1 cKO星形胶质细胞的转录组谱在重复样本间表现出高度可重复性。DEG分析在NR3C1 cKO星形胶质细胞中识别出2256个下调基因和1895个上调基因。DEG与星形胶质细胞发育过程中从P7到P30表达的基因显著重叠。

具体来说，NR3C1 cKO星形胶质细胞中上调的基因在很大程度上与P7和P17表达的发育基因重叠，而下调基因在P17和P30表达的基因中富集，支持NR3C1在早期出生后阶段的功能意义。尽管基因表达有这些显著变化，但令人惊讶的是，NR3C1 cKO小鼠在正常发育过程中没有表现出可观察到的表型变化。星形胶质细胞特异性NR3C1缺失不影响星形胶质细胞群体、形态或标志基因表达。

考虑到NR3C1与免疫相关神经系统疾病的关联，研究人员还检查了NR3C1 cKO星形胶质细胞中免疫应答基因的表达。出乎意料的是，NR3C1 cKO星形胶质细胞中的DEG在上调或下调基因中都没有显示出免疫反应通路的显著富集。此外，NR3C1 cKO星形胶质细胞显示反应性星形胶质细胞标志物的表达没有变化。

鉴于NR3C1靶基因似乎与MS和自身免疫性疾病相关，研究人员假设当引入额外的免疫刺激时，NR3C1缺失可能产生生理后果。为了测试这一假设，他们再次通过向Aldh1l1-creERT2; Nr3c1^fl/fl小鼠在P0注射4-OHT诱导星形胶质细胞特异性NR3C1缺失，然后在9周龄时通过使用MOG_35-55肽诱导EAE施加免疫挑战。

他们发现，与非EAE（初始）对照相比，EAE诱导后星形胶质细胞中NR3C1表达保持不变。尽管如此，他们观察到星形胶质细胞NR3C1 cKO显著恶化了EAE的进展，临床评分显著加剧。大约一半的NR3C1 cKO小鼠达到临床评分5，表现为突然死亡或严重瘫痪。

值得注意的是，虽然在初始条件下Cre对照和NR3C1缺失星形胶质细胞中反应性星形胶质细胞标志物GFAP的表达水平相当，但NR3C1 cKO小鼠在EAE进展期间显示GFAP表达显著增加。与Cre对照小鼠相比，患有EAE的NR3C1 cKO小鼠也显示IBA1表达增加，尽管增加程度不如GFAP明显。有趣的是，这伴随着脑浸润CD4⁺ T细胞数量的增加，这些细胞是EAE进展过程中的主要效应细胞。

研究人员在EAE诱导后观察到NR3C1 cKO小鼠脊髓和小脑中GFAP和IBA1表达类似增加。此外，NR3C1 cKO小鼠显示脊髓中CD45⁺免疫细胞和CD4⁺ T细胞数量增加，表明NR3C1调节超越皮质的多个CNS区域中的星形胶质细胞介导的免疫反应。

snRNA-seq分析揭示EAE高峰期NR3C1介导的免疫反应

为了阐明NR3C1 cKO如何导致加重的EAE表型，研究人员使用10X Genomics v3.1平台对在EAE高峰期收集的皮质进行了单核RNA-seq（snRNA-seq），对Cre对照和NR3C1 cKO星形胶质细胞各有两个生物学重复。

使用规范的Scanpy框架，总共保留了44,548个核，并聚类成八种不同的细胞类型，没有样本偏差。细胞类型包括星形胶质细胞（Slc1a2、Aldh1l1）、少突胶质细胞（Olig1、Olig2）、小胶质细胞（C1qa、Tmem119）、神经元（Slc17a7、Rbfox3）、少突胶质细胞前体细胞（Pdgfra）、室管膜细胞（Tmem212）、脑膜细胞（Slc47a1）和两种内皮细胞类型（Cldn5和Rgs5）。

为了揭示NR3C1 cKO小鼠中加重EAE表型的分子机制，研究人员专注于星形胶质细胞群体。在NR3C1 cKO星形胶质细胞中，与EAE高峰期的Cre对照相比，识别出1271个下调的和756个上调的EAE应答基因。为了确定这些基因是否在 distinct 星形胶质细胞亚群内特异性改变，他们进行了亚聚类分析，揭示了五个不同的星形胶质细胞亚群。

尽管以Gfap和Tnc表达为标志的亚群C2在EAE高峰期的NR3C1 cKO小鼠中显示轻微扩张，但EAE应答基因在所有星形胶质细胞亚群中全局失调。例如，星形胶质细胞免疫应答基因如Igfbp5、Notch1、Stat2和Gfap在所有亚群中一致上调。

为了进一步评估EAE应答基因的病理相关性，研究人员将他们的数据与从MS患者获得的转录组数据集进行了比较。在EAE高峰期NR3C1 cKO星形胶质细胞中上调或下调的基因分别在活动性MS病灶中显示一致较高或较低的表达。对MS病灶的分层分析，包括正常表现白质（NAWM）、活动性病灶（AL）、慢性活动性病灶（CAL）、慢性非活动性病灶（CIL）和再髓鞘化病灶（RL），进一步证实了在NR3C1 cKO星形胶质细胞中上调的基因在炎症性病灶类型（AL和CAL）中表达更高，而下调基因在这些相同区域与较少炎症病灶（CIL和RL）相比显示减少的表达。

为了进一步表征EAE中NR3C1 cKO小鼠的免疫失调，研究人员分析了EAE应答DEG中Hallmark通路的富集。他们发现TNF-α信号基因下调，而II型干扰素、IL-2和IL-6应答基因在NR3C1 cKO星形胶质细胞中上调。一致地，活动性MS病灶中TNF-α信号、II型干扰素和IL-2/STAT5应答基因的表达模式反映了在NR3C1 cKO星形胶质细胞中观察到的那些，表明NR3C1缺失后全局免疫失调。

最后，NR3C1已知与糖皮质激素应答元件（GRE）结合以激活靶基因，同时还通过与AP-1或NF-κB蛋白相互作用拴在染色质上以介导负调节。考虑到NR3C1的双重功能角色，研究人员探索了在脂多糖（LPS）和地塞米松处理后在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中被NR3C1抑制的基因。有趣的是，在免疫挑战时被NR3C1抑制的基因在EAE高峰期的NR3C1 cKO小鼠中上调。这些发现表明在EAE期间NR3C1 cKO星形胶质细胞中观察到的加重免疫反应反映了MS的分子特征，可能源于NR3C1依赖性基因调节的抗炎功能的丧失。

NR3C1缺失表观遗传地 predisposes 炎症应答基因

尽管在非EAE条件下NR3C1 cKO星形胶质细胞缺乏可观察到的表型，但NR3C1 cKO星形胶质细胞表现出加重的EAE表型，其特征在于炎症基因如IFN-γ和IL-2的上调。为了解释这一现象，研究人员假设NR3C1缺失可能在早期出生后阶段表观遗传地引发这些炎症基因，从而创建对EAE诱导的选择性脆弱性。

为了测试这一假设，他们通过使用从P17 Cre对照和NR3C1 cKO小鼠纯化的非EAE星形胶质细胞进行ATAC-seq检查了基因活性得分和cCRE可及性。如预期的那样，在有或没有EAE诱导的NR3C1 cKO小鼠中常见上调和下调的基因在EAE诱导前显示一致的上调或下调基因表达和基因可及性。

然而，令人惊讶的是，相当比例的EAE特异性上调基因在EAE诱导前甚至在NR3C1 cKO星形胶质细胞中表现出更高的基因可及性，尽管它们的表达水平在这个阶段没有区别。相比之下，EAE特异性下调基因的基因表达和可及性在EAE诱导前已经被NR3C1缺失改变。

研究人员检查了与上调和下调EAE特异性应答基因连接的cCRE可及性。使用在P17星形胶质细胞中由ABC得分定义的远程cCRE-启动子相互作用，他们识别了936个和1580个分别与上调和下调EAE应答基因连接的cCRE。基于有或没有NR3C1 cKO的可及性变化对这些cCRE进行排序，他们观察到这些cCRE中的许多在EAE诱导前已经一致地开放或关闭，表明EAE应答基因的表观遗传 predisposition。

接下来，为了确定NR3C1依赖性表观遗传 predisposition 是否持续到后期阶段，研究人员使用在P0诱导NR3C1 cKO后从12周龄（12W）小鼠的星形胶质细胞进行了RNA-seq和ATAC-seq。有趣的是，他们发现基因表达模式和改变的基因可及性甚至在12W时仍然持续。此外，在P17与EAE特异性上调基因连接的581个差异可及峰中，33.6%在12W时保留了它们改变的染色质可及性，支持早期NR3C1缺失对EAE中免疫应答基因表观遗传引发的持久影响。

他们通过比较在P0（早期出生后）与P30（成熟阶段）诱导的NR3C1 cKO星形胶质细胞进一步评估了这种效应的发育阶段特异性。12W时的RNA-seq和ATAC-seq分析显示，P30诱导的NR3C1 cKO未能重现P0诱导的NR3C1 cKO中观察到的表观遗传改变。只有5.5%的与EAE特异性上调基因连接的差异可及峰在P30诱导的NR3C1 cKO中保留。此外，在P30诱导的cKO小鼠中12W时的差异表达基因与在同一时间点P0诱导的cKO小鼠中观察到的那些相比表现出不同的功能富集模式。这些发现强调了一个关键的发育窗口，其中NR3C1调节星形胶质细胞免疫应答基因的持久表观遗传编程。

背景依赖性NR3C1在表观遗传 predisposition 中的调节作用

先前的研究表明NR3C1二聚化可能激活基因表达，而其与其他转录因子如AP-1和NF-κB的相互作用可能抑制基因表达，尽管两种功能都需要NR3C1与基因组的结合。为了测试这种可能性并确认观察到的表观遗传 predisposition 是直接由NR3C1缺失驱动的，研究人员在星形胶质细胞上进行了NR3C1和c-JUN ChIP-seq。

NR3C1 ChIP-seq峰在与上调和下调基因连接的cCRE中显著富集，表明异常的EAE应答基因表达与NR3C1结合直接相关。为了研究NR3C1的背景依赖性调节作用，研究人员将基因组区域分类为NR3C1-only和NR3C1/c-JUN共结合位点，其中c-JUN是AP-1复合物的核心组件。

他们发现下调基因位于NR3C1-only和NR3C1/c-JUN共结合区域附近，而上调基因主要与NR3C1/c-JUN共结合区域相关。这些结果表明NR3C1可能根据其结合伙伴在星形胶质细胞中发挥 distinct 调节作用。研究人员还对与EAE上调和下调基因连接的cCRE进行了 motif 分析。值得注意的是，具有上调基因的cCRE富含STAT5、BCL6、ETS和JUN家族转录因子 motif，暗示额外免疫相关转录因子在NR3C1缺失后EAE应答基因失调中的参与。

总的来说，数据表明NR3C1作为调节从早期出生后发育开始星形胶质细胞免疫应答的关键转录因子。尽管NR3C1缺失本身不会导致可观察到的表型，但它表观遗传地 predisposes 星形胶质细胞免疫应答基因，这些基因在后期阶段持续存在。在免疫刺激时，这些引发的cCRE迅速诱导炎症基因的表达，触发在EAE中加重的免疫反应。此外，在MS患者胼胝体中NR3C1表达的微妙减少表明NR3C1在大脑免疫反应中的作用超越了小鼠EAE模型。

研究结论与意义

这项研究深入探索了星形胶质细胞如何通过发育过程中的阶段特异性基因调控网络获得其功能特性。利用多组学方法，包括转录组、cCRE活性和远程cCRE-启动子相互作用，研究人员描绘了多个发育阶段（E16到P30）的动态调控景观，揭示了星形胶质细胞成熟的关键时间窗口。

整合分析揭示了关键转录和表观遗传转变，包括识别NR3C1和其他在中期发育窗口（P1-P7）短暂活跃的转录因子如IEG和核受体。这些转录因子可能有助于建立多样的星形胶质细胞功能。其中，NR3C1（编码糖皮质激素受体，GR）作为一个中央调节因子出现。其在早期出生后发育期间的缺失导致持久的表观遗传失调和EAE诱导后加重的免疫反应，尽管在基线时没有可观察到的表型。

这些发现突显了一个更广泛的原则：在离散发育窗口期间的转录因子活性可以建立长期表观遗传 predisposition，增加晚年疾病易感性。这一发现与最近暗示星形胶质细胞表观遗传记忆在CNS病理中的研究一致。

该研究强调了NR3C1编码GR的病理相关性和治疗意义，GR是一种通过GC结合激活的转录因子，调节抗炎转录程序。考虑到GC在管理急性MS复发中的广泛临床使用，理解NR3C1在CNS中的细胞和分子机制具有关键的治疗重要性。

在人类中，NR3C1的甲基化与围产期应激相关，如母亲心理问题、父母离婚或住院。高度DNA甲基化减少外周血和脑组织中NR3C1表达。一致地，与健康对照相比，在MS患者中也观察到NR3C1表达减少，表明NR3C1失调与MS病理之间存在潜在联系。

超越其诊断相关性，NR3C1可能在GC治疗后受到持久调节，需要在治疗背景中仔细考虑。已知GC治疗在免疫细胞中诱导持久的表观遗传变化。例如，地塞米松暴露导致FKBP5增强子区域 transient 去甲基化，上调其表达。升高的FKBP5反过来损害GR核转位并减少其转录活性，从而有助于GC抵抗。在MS患者中，高剂量甲基强的松龙治疗触发外周血中ZBTB16的持久低甲基化，进一步支持GC诱导的表观遗传印记可以是持久的观点。

这些发现集体表明GC治疗可以通过持久表观遗传机制重编程免疫细胞。鉴于NR3C1类似地调节星形胶质细胞中的免疫调节，重复GC暴露可能在星形胶质细胞中诱导 comparable 表观遗传修改是合理的。然而，需要进一步研究证明GC治疗是否在星形胶质细胞中诱导表观遗传变化。

尽管这项研究提供了重要见解，几个挑战仍然存在于完全阐明星形胶质细胞发育的分子机制。首先，研究发现基于小鼠模型，可能不能完全反映人类星形胶质细胞发育和疾病病因的复杂性。未来研究应专注于在体外分化的人类星形胶质细胞或人脑类器官中验证结果。第二，NR3C1依赖性免疫抑制的精确表观遗传机制有待澄清。虽然研究表明NR3C1和c-JUN之间的组合活性对EAE应答基因具有 distinct 调节效应，但需要更全面的分析来识别与NR3C1相互作用的额外辅助因子。

此外，虽然研究强调了早期出生后NR3C1对加重免疫反应易感性的作用，但需要进一步研究确定表观遗传引发在星形胶质细胞中的确切持续时间和影响，超越MS的各种免疫相关疾病。最后，虽然研究专注于NR3C1缺失，但也揭示了16个其他转录因子在中期发育中的参与。此外，NR3C1属于核受体亚家族3，C组，还包括盐皮质激素受体（MR，NR3C2）、雄激素受体（AR）和孕激素受体（PGR）。这些受体共享结构相似性和染色质结合序列，通常在背景依赖性方式中相互作用。最近研究强调了NR3C2在星形胶质细胞发育中作为转录因子和免疫调节剂的功能。考虑到这些发现，需要进一步研究确定这些核受体和其他中期阶段特异性转录因子在塑造星形胶质细胞特性和免疫反应中的潜在功能相互作用。

总之，这项研究提供了对星形胶质细胞发育调控机制的深刻理解，揭示了NR3C1在早期发育阶段建立免疫应答表观遗传记忆中的关键作用，为神经系统疾病的治疗干预提供了新的靶点和思路。