一种与DIVA（诊断增强试剂）兼容的牛分枝杆菌三重突变疫苗在小鼠模型中能够提供对牛结核病的保护作用

《Veterinary Immunology and Immunopathology》：A DIVA-Compatible Mycobacterium bovis Triple Mutant Vaccine Confers Protection Against Bovine Tuberculosis in mouse model

牛结核病疫苗研发中，评估不含ESAT-6、CFP-10和Ag85A的三重突变体疫苗单独及prime-boost联合使用效果，发现肺部保护与BCG相当，脾脏保护优于三重突变体，且疫苗诱导CD4+KLRG1-CXCL3+免疫细胞显著增加。

　　这篇文章描述了一项关于牛结核病（bTB）疫苗的研究，重点评估了一种三重突变株在小鼠模型中的保护效果。牛结核病是由牛分枝杆菌（*Mycobacterium bovis*）引起的一种慢性肺部感染疾病，影响着全球范围内的牲畜和多种哺乳动物，包括人类。尽管该疾病对畜牧业产生了显著的经济影响，目前尚无有效的商业疫苗，部分原因是疫苗可能干扰标准的诊断测试。因此，开发一种既具有保护效果又不影响诊断的疫苗成为研究的重要方向。

研究人员在本项研究中评估了一种三重突变株，该突变株缺失了两个关键的免疫主导抗原ESAT-6和CFP-10，以及一个重要的毒力因子Ag85A。这些抗原的缺失使得该突变株在免疫检测中不会干扰现有的诊断方法，从而满足了DIVA（区分疫苗接种动物与自然感染动物）策略的要求。此外，这种突变株还被用于一种新的疫苗策略——异源加强免疫（prime-boost regimen），即首先使用该突变株进行初次免疫，随后使用携带重组Ag85A蛋白的壳聚糖/藻酸盐纳米胶囊进行加强免疫。Ag85A是牛分枝杆菌疫苗设计中的核心抗原，参与细胞壁的合成，并在毒力和免疫原性方面起着关键作用。它能够激发强烈的T细胞反应，因此在疫苗研究中被广泛研究。

研究采用小鼠作为实验模型，通过量化感染后肺部和脾脏中的结核杆菌菌落数（CFUs）来评估疫苗的保护效果。在感染五周后，所有接种疫苗的小鼠在肺部均表现出相似的保护水平，而脾脏中的菌落数则明显低于未接种疫苗的对照组。然而，在感染十周后，肺部的保护效果在初次接种和加强接种组中尤为显著，而脾脏中的保护仅限于加强接种组。这一结果表明，三重突变株在短期模型中未能达到与BCG疫苗相同水平的肺部保护效果，但在长期感染中可能具有一定的保护潜力。

为了进一步了解疫苗的作用机制，研究人员还分析了接种疫苗后小鼠的免疫反应。他们关注了一种特定的CD4+ T细胞亚群，即CD4+KLRG1-CXCL3+ T细胞，该细胞群体此前被认为与抗结核病免疫有关。结果显示，接种疫苗的小鼠在感染后表现出这一细胞群体的显著扩增，而未接种疫苗的对照组则没有这种现象。值得注意的是，这些细胞的频率与肺部细菌负担的减少之间存在正相关，这表明它们可能在抗结核免疫中发挥重要作用，并可以作为评估疫苗保护效果的潜在生物标志物。

在疫苗研发过程中，免疫策略的选择至关重要。异源加强免疫是一种常用的疫苗增强方法，它通过使用不同的抗原或递送系统来激活和增强免疫应答。在本研究中，研究人员采用了异源加强策略，将三重突变株作为初次疫苗，随后使用携带Ag85A蛋白的纳米胶囊进行加强。这种方法的目的是利用不同的抗原来源，激发更全面的免疫反应，从而提高疫苗的保护效果。纳米胶囊作为一种新型的抗原递送系统，具有多种优势，包括良好的黏膜粘附性、能够增强局部和全身免疫反应，以及能够有效进入淋巴系统，促进抗原呈递。这些特性使得纳米胶囊在针对细胞内病原体如牛分枝杆菌的疫苗开发中具有独特的应用潜力。

研究还指出，纳米胶囊不仅能够提高抗原的递送效率，还可能影响免疫系统的反应模式。例如，使用纳米胶囊递送Ag85A蛋白可能有助于更有效地激活T细胞，从而增强免疫应答。然而，研究结果表明，尽管加强接种在一定程度上提升了疫苗的保护效果，但在肺部的保护作用并未超过三重突变株单独接种的效果。这可能意味着，虽然异源加强策略在某些方面是有效的，但还需要进一步优化以达到更理想的保护水平。

此外，研究强调了在评估疫苗效果时，延长组织匀浆培养时间的重要性。通常情况下，结核杆菌的菌落数是在感染后较短的时间内进行计数，但研究人员发现，某些细菌亚群需要更长的培养时间才能形成可见的菌落。这一发现表明，传统的菌落数计数方法可能低估了疫苗的实际保护效果，特别是在评估长期感染情况时。因此，改进和优化CFU计数方法对于准确评估疫苗的保护作用具有重要意义。

在实验设计方面，研究采用了严格的伦理标准，所有动物实验均获得了机构动物伦理委员会（CICUAE）的批准，并且在实验过程中得到了妥善的动物护理和使用。这体现了研究在科学探索的同时，也充分考虑了动物福利和伦理问题，确保实验的合规性和可靠性。

总的来说，这项研究提供了一个新的视角，探讨了三重突变株在不同免疫策略下的保护效果，并揭示了其在小鼠模型中的免疫反应机制。尽管在短期模型中三重突变株未能表现出与BCG疫苗相同的保护水平，但其在长期感染中的表现以及对特定免疫细胞群体的激活表明，它仍然具有潜在的疫苗开发价值。未来的研究可以进一步探索该突变株与其他疫苗策略的结合，以提高其在不同感染模型中的保护效果。此外，优化纳米胶囊的抗原递送方式，以及改进菌落数计数方法，也将是推动疫苗研发的重要方向。