口腔细菌中犬尿氨酸酶（KynU）的鉴定与功能验证：揭示微生物代谢新机制及其在宿主-微生物互作中的潜在意义

本研究系统鉴定并验证了多种口腔细菌中犬尿氨酸酶（KynU）的功能，发现Burkholderia cepacia、Ralstonia pickettii和Stenotrophomonas maltophilia等菌株可有效将犬尿氨酸（KYN）转化为邻氨基苯甲酸（AA）。该研究通过生物信息学分析、结构模拟（TM-score/RMSD）、重组蛋白表达及液相色谱-质谱（LC-MS）技术，首次证实口腔微生物群存在活跃的KYN代谢通路，为理解微生物代谢产物调控口腔免疫及神经调节机制提供了新视角，对口腔疾病（如牙周炎）及菌群-脑轴研究具有重要启示。

　　

摘要

背景

犬尿氨酸（KYN）通路在人类免疫调节和神经调节中产生关键代谢物，但其在口腔微生物组中的存在和活性尚不明确。本研究旨在探究口腔细菌中关键犬尿氨酸酶（KynU）的功能，该酶催化KYN转化为邻氨基苯甲酸（AA）。

方法

通过生物信息学分析鉴定口腔细菌基因组中的推定kynU基因，并使用模板建模（TM）分数和均方根偏差（RMSD）分析评估预测蛋白的结构相似性。将选定的kynU序列克隆到pBAD-His A表达载体中，通过液相色谱-质谱（LC-MS）定量AA浓度来评估酶活性。

结果

在71个物种中，鉴定出7种口腔细菌具有kynU。结构分析表明，来自4个物种的KynU可能折叠为功能酶。来自Burkholderia cepacia、Ralstonia pickettii和Stenotrophomonas maltophilia的三种重组KynU产生可检测水平的AA（分别为21.27 ± 12.0 μM、19.59 ± 8.6 μM和46.43 ± 36.8 μM），证实了功能性的KYN向AA的转化。

结论

本研究证明了口腔细菌中KynU的活性，揭示了微生物代谢的一个未被认识的方面，对宿主-微生物相互作用具有潜在意义。需要进一步研究以阐明细菌KYN代谢物的生物学意义及其在口腔疾病中的作用。

关键信息

1. 1.

   生物信息学和结构分析表明，犬尿氨酸（KYN）通路存在于口腔细菌中。

2. 2.

   口腔细菌如Burkholderia cepacia、Ralstonia pickettii和Stenotrophomonas maltophilia具有功能性KynU酶，可将KYN转化为邻氨基苯甲酸。

3. 3.

   本研究通过重组表达和LC-MS实验证实了口腔细菌中活跃的KYN代谢。

引言

色氨酸（Trp）是人类的一种必需氨基酸，从饮食来源获取，主要在小肠吸收。除了其在蛋白质合成中的作用外，Trp还是多种关键生物活性代谢物的前体，包括褪黑素、血清素和犬尿氨酸（KYN）。因此，Trp代谢及其代谢物与神经信号和免疫调节等重要生物过程高度相关。尽管Trp可以通过多种途径分解代谢产生多种代谢物，但主要途径是KYN通路，约占Trp分解代谢的95%。KYN通路还需要一系列多步酶促反应，产生众多代谢物。作为Trp的主要分解代谢途径，其主导地位突出了KYN代谢物在细胞调节中的生物学重要性。

KYN代谢物表现出多样的生物功能。犬尿酸（KYNA）通过清除活性氧物种起到抗氧化作用，而3-羟基-L-犬尿氨酸（3-HK）和喹啉酸（QA）则有助于氧化应激。邻氨基苯甲酸（AA）和KYN根据细胞环境作为抗氧化剂或促氧化剂。此外，QA和KYNA发挥不同的神经元效应；QA促进神经元兴奋性，而KYNA具有神经保护作用。吡啶甲酸（PIC）对多种细菌如Mycobacterium avium复合体和Staphylococcus aureus表现出抗菌活性。因此，KYN通路失调与多种疾病相关，包括神经障碍、炎症性疾病和自身免疫性疾病。此外，升高的KYN代谢物水平可能在牙周炎中起作用。

在人类中，Trp通过色氨酸2,3-双加氧酶（TDO, EC 1.13.11.11）或吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO1/IDO2, EC 1.13.11.52）的酶活性通过KYN途径转化，形成N′-甲酰犬尿氨酸，后者通过甲酰胺酶（EC 3.5.1.9）转化为KYN。KYN通过犬尿氨酸氨基转移酶（KATs, EC 2.6.1.7）分解代谢为KYNA，通过犬尿氨酸酶（KynU, EC 3.7.1.3）转化为AA，或通过犬尿氨酸单加氧酶（KMO, EC1.14.13.9）转化为3-HK。AA和3-HK随后分解代谢为3-羟基邻氨基苯甲酸，进而产生QA或PIC。QA最终用于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）的生物合成，这是一种用于众多代谢过程和能量生产的重要辅因子。

一些细菌可以表达TDO或IDO，使它们能够通过KYN途径分解代谢Trp。然而，细菌KYN通路的研究仍然不足，其在影响人类健康中的作用尚未完全理解。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种机会性病原体，是少数具有充分表征的KYN通路的细菌之一。铜绿假单胞菌表达TDO，能够通过KYN途径分解代谢Trp。铜绿假单胞菌还携带kynU基因，编码KynU，这是一种磷酸吡哆醛（PLP）依赖性酶，水解KYN为AA，与人类中的功能相似。铜绿假单胞菌中的AA是产生Pseudomonas喹诺酮信号（PQS）的前体，这是一种关键的群体感应信号分子，调节细菌毒力和群体行为如生物膜形成。铜绿假单胞菌产生的AA还对其他细菌如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和肠沙门氏菌（Salmonella enterica）表现出抗生物膜活性。

某些肠道细菌门，包括厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria），已知携带kynU基因，这些细菌在口腔腔中也常见。然而，基因的存在并不确认酶的功能性。虽然细菌参与宿主KYN代谢的影响尚不清楚，但它可能改变下游代谢物水平并影响宿主健康。本研究鉴定了口腔细菌中的kynU基因，并证实了它们在将KYN转化为AA中的催化活性，表明其在调节口腔KYN代谢中的潜在作用。

材料与方法

鉴定携带KynU编码基因的细菌

使用基本局部比对搜索工具（BLAST）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）鉴定细菌基因tdo、ido和kynU，这些基因编码KYN通路中的关键酶。使用TDO（EC 1.13.11.11）和IDO（EC 1.13.11.52）的EC编号从KEGG数据库检索所有直系同源物，基于现有注释。使用扩展的人类口腔微生物组数据库（eHOMD）验证从鉴定数据中获得的口腔细菌列表。为了鉴定这些口腔细菌中的kynU，进行了两种方法。首先，使用铜绿假单胞菌PAO1的kynU序列（登录号NC002516.2）作为查询进行BLAST搜索，e值截止值≤?0.001。其次，直接从KEGG数据库检索kynU直系同源物，使用现有注释。

蛋白质比对和结构比较

从KEGG数据库检索的所有细菌tdo和ido的氨基酸序列用于比对和构建系统发育树，使用MEGA11。使用SnapGene v7.2进行口腔细菌KynU的蛋白质序列比对。使用AlphaFold2和AlphaFold DB预测KynU的3D蛋白质结构。使用模板建模（TM）分数和均方根偏差（RMSD）分析评估结构相似性。

TM分数基于对齐残基之间的距离提供蛋白质之间结构相似性的定量评估。RMSD是基于等效原子之间距离的叠加蛋白质结构之间的测量。

参考蛋白质结构和预测模型以蛋白质数据库（PDB）文件格式通过TM分数在线工具进行分析。使用人类（Homo sapiens）、小鼠（Mus musculus）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）、细菌（铜绿假单胞菌和荧光假单胞菌）的KynU结构作为参考蛋白质进行比较分析。

将kynU基因克隆到表达载体中

来自Burkholderia cepacia、Cupriavidus gilardii、H. sapiens、P. aeruginosa、P. fluorescens、P. otitidis、Ralstonia pickettii和Stenotrophomonas maltophilia的kynU基因经过合成、测序验证，并通过XhoI和HindIII位点克隆到pBAD-His A载体中。这些细菌基因的选择基于鉴定的携带kynU的口腔细菌列表。纯化质粒并转化到大肠杆菌DH10B中。构建体分别命名为kynUBC、kynUCG、kynUHS、kynUPA、kynUPF、kynUPO、kynURP和kynUSM。质粒序列可在补充表1中找到。

细菌培养条件

重组大肠杆菌在37?°C下在含有100?μg?mL^?1氨苄青霉素的LB琼脂上过夜培养，然后接种到含有100?μg?mL^?1氨苄青霉素的LB肉汤中，并在200?rpm摇动下过夜生长，用于后续实验。

蛋白质提取

将LB肉汤中的过夜培养物亚培养至OD600 0.06–0.08，并在37?°C下孵育2?小时，直至OD600达到0.4–0.6。将培养物分为诱导（0.1% w/v阿拉伯糖）和非诱导组，然后在37?°C下孵育3?小时。离心沉淀细胞（4,000?×?g，10?分钟，4?°C），用PBS洗涤两次，并重悬于120?μL球质体缓冲液中，其中含有2?μL的25?×蛋白酶抑制剂和500 U?mL^?1 mutanolysin。在37?°C下15?分钟后，使用TissueLyser LT以50?Hz振荡2?分钟，用50?μL的0.1 mm玻璃珠裂解细胞。收集含有总蛋白质的上清液并储存于–80?°C。

蛋白质凝胶电泳和Western blot分析

每样品5?μg蛋白质通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）解析，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，与辣根过氧化物酶偶联的6×-His标签单克隆抗体（HIS.H8）孵育1小时。抗体在含有0.05% (v/v) Tween 20 (PBST)和5% (w/v)脱脂牛奶的PBS中以1:500稀释。用PBST缓冲液洗涤三次后，使用Clarity? Western ECL底物显色蛋白条带。

KynU功能表征

将LB肉汤中的过夜培养物离心沉淀（4,000?×?g，10?分钟，4?°C），用PBS洗涤两次，重悬，并亚培养到含有100 μg?mL^?1氨苄青霉素和1% (w/v)葡萄糖的RPMI 1640培养基中。使用RPMI 1640培养基代替LB培养基，因为RPMI 1640培养基是一种化学成分明确的确定培养基，而LB培养基是一种复杂培养基，其代谢物组成可变，可能影响功能表征的结果。培养物以OD600 0.06–0.08开始，并在37?°C下孵育2?小时，直至达到OD600 0.4–0.6。用0.1% (w/v)阿拉伯糖诱导表达3?小时，然后分为两组：添加或不添加1?mM KYN。两组均加入70?μM PLP，并在37?°C下孵育30?分钟，然后在14,000?×?g下离心收集上清液用于细胞外代谢物分析。细胞内代谢物通过加入400?μL含有0.2% (v/v)甲酸的80% (v/v)乙腈提取，涡旋，并在冰上孵育10?分钟，然后在4?°C下以14,000?×?g离心10?分钟。构建体kynUPA和pBAD24分别作为阳性和阴性对照。所有样品通过液相色谱-质谱（LC-MS）分析。

标准对照制备和LC-MS分析

使用L-犬尿氨酸、犬尿酸、邻氨基苯甲酸、喹啉酸和2-吡啶甲酸作为标准品。基于先前发布的方法进行代谢物分析，使用2?μL样品注射在Xevo TQ-S三重四极杆质谱仪上。分离在2.1?×?150 mm Acquity UPLC HSS T3 1.8?μm柱上进行，温度为50?°C，流速为200?μL?min^?1。分析物浓度通过校准曲线从峰面积确定。

结果

携带kynU的细菌

从KEGG数据库的系统数据库搜索鉴定出71个携带tdo的物种，包括eHOMD中列出的8种口腔细菌，以及57个携带ido的物种，包括eHOMD中列出的5种口腔细菌。BLAST搜索和直接KEGG数据库检索的组合验证了7种口腔细菌同时携带tdo和kynU，包括B. cepacia、C. gilardii、P. aeruginosa、P. fluorescens、P. otitidis、R. pickettii和S. maltophilia。鉴定的细菌中没有同时携带ido和kynU的。

KynU比对和结构比较

将鉴定的口腔细菌的KynU序列与人类、小鼠和酵母的序列进行同一性比较。序列比对显示，大多数细菌序列与来自H. sapiens (KynUHS)、M. musculus (KynUMM)和S. cerevisiae (KynUSC)的KynU序列共享约30%的同一性。来自S. maltophilia (KynUSM)的KynU序列与真核序列显示约40%的同一性，与来自P. aeruginosa (KynUPA)和P. fluorescens (KynUPF)的KynU显示约35%的同一性。来自B. cepacia (KynUBC)、C. gilardii (KynUCG)、P. otitidis (KynUPO)和R. pickettii (KynURP)的KynU序列与KynUPA显示约70%的同一性。

除了序列同一性结果外，还基于TM分数和RMSD值进行了结构比较，其中TM分数 above 0.5表明两种蛋白质结构共享整体相似的折叠，RMSD值 above 0.3?nm被认为是结构差异。细菌KynU与真核KynU显示结构差异（TM分数??0.3?nm），除了KynUSM与KynUSC显示一定程度的相似性（TM分数?=?0.32，RMSD?=?0.21?nm）。KynUSM还与KynUPF显示部分相似性（TM分数?=?0.17，RMSD?=?0.23?nm）。KynUPO与KynUPA显示相似的折叠（TM分数?=?0.99，RMSD?=?0.03?nm）。KynUBC与KynUPA显示相似的整体折叠，但注意到局部结构差异（TM分数?=?0.78，RMSD?=?0.39?nm）。KynUCG在结构上与KynUPA（TM分数?=?0.16，RMSD?=?0.35?nm）和KynUPF（TM分数?=?0.15，RMSD?=?0.36?nm）都不相似，而KynURP的结构分析由于缺乏完全预测的模型而不适用；因此，无法确定KynURP的结构相似性。

KynU蛋白质表达

鉴于口腔细菌KynU蛋白质与来自真核生物和假单胞菌的功能性KynU酶之间的结构相似性，表达候选蛋白质并测试其酶活性。为了验证重组大肠杆菌的蛋白质表达，进行了0.1% (w/v)阿拉伯糖的诱导，成功促进了来自构建体kynUHS (56.2?kDa)、kynUPF (47.8?kDa)和kynUPA (47.14?kDa)以及实验组kynUBC (46.39?kDa)、kynUCG (28.01?kDa)、kynUPO (46.63?kDa)、kynURP (46.75?kDa)和kynUSM (47.84?kDa)的KynU表达，如免疫印迹所示。在pBAD24和非诱导对照中未检测到蛋白质条带。这些结果提供了定性确认，表明本研究中的细菌kynU基因不是假基因，因为它们的表达产生了与KynU序列和His标签（0.84?kDa）分子量相对应的蛋白质大小。

KynU酶功能测试

在确认蛋白质表达后，使用LC-MS评估了KynU将KYN分解代谢为AA的酶功能。测量KYN浓度以确认其在样品中的存在。在添加KYN的组中检测到总KYN：kynUBC (695.81?±?493.5?μM)、kynUCG (456.05?±?470.3?μM)、kynURP (621.05?±?425.8?μM)、kynUSM (798.93?±?482.0?μM)、kynUPA (705.93?±?365.9?μM)和pBAD24 (781.40?±?414.8?μM)。未添加KYN的组，包括单独的RPMI培养基，显示KYN浓度低于检测限（

结果显示，在添加KYN的组中检测到总AA：kynUBC (21.27?±?12.0?μM)、kynURP (19.59?±?8.6?μM)、kynUSM (46.43?±?36.8?μM)和kynUPA (12.77?±?5.4?μM)，后者作为阳性对照，因为已知铜绿假单胞菌的KynU可将KYN转化为AA。相反，kynUCG和对照条件，包括pBAD24、添加或不添加KYN的RPMI培养基，以及所有非添加KYN的组，显示AA浓度低于检测限（

为了评估口腔细菌KynU是否在KYN通路中具有双重功能，还测量了KYNA、QA和PIC的浓度。在添加KYN的实验组中检测到总KYNA产生，包括kynUBC (22.42?±?15.6?μM)、kynUCG (81.12?±?10.3?μM)、kynURP (43.33?±?30.1?μM)、kynUSM (82.21?±?51.9?μM)、kynUPA (62.49?±?49.5?μM)和pBAD24 (124.59?±?61.5?μM)。添加或不添加KYN的RPMI培养基，以及未添加KYN的实验组，显示无可检测的KYNA水平（

在所有条件下均未检测到QA和PIC。构建体kynUHS和kynUPF在两次生物学重复中未能产生可检测的AA水平，而kynUPO显示的结果不一致，从不可检测到阈值以上水平。因此，这三种构建体被排除在解释之外。细胞外和细胞内KYN、AA和KYNA的比率显示高度变异性，细胞内代谢物在一次试验中未检测到。因此，此处报告的每种代谢物的值为总浓度。

讨论

KYN是人类几种生物活性代谢物的前体。虽然一些细菌可以将Trp转化为KYN，但细菌KYN通路仍然知之甚少。本研究表明，几种口腔细菌，包括B. cepacia、R. pickettii和S. maltophilia，具有KYN通路基因，并可以通过KynU从KYN产生AA。

很少有细菌被鉴定出具有KynU，特征最明确的例子是KynUPA和KynUPF。生物信息学分析揭示了7种口腔细菌携带tdo和kynU，所有这些都属于变形菌门，与先前表明变形菌门理论上具有KYN通路基因的研究一致。虽然变形菌门在口腔腔中丰富，但伯克霍尔德菌科、假单胞菌科和黄色杆菌科在人类口腔微生物组中的流行率相对较低。然而，口腔菌群失调可能导致这些细菌的丰度增加，这可能与口腔疾病如牙周炎相关。越来越多的证据也支持它们在口腔生态位中的存在，例如：铜绿假单胞菌已从龈下斑块中分离出来，伯克霍尔德菌属和罗尔斯顿菌属已在牙髓样本中检测到。口腔中嗜麦芽窄食单胞菌的定植与长期抗生素使用有关。这些发现强调了研究这些细菌特征的重要性，特别是它们的KYN通路与宿主-病原体相互作用的关系。

鉴于这些口腔细菌的鉴定，本研究通过序列同一性、结构分析、蛋白质表达和功能表征，系统研究了来自鉴定的口腔细菌的KynU。基于同源建模，将KynU序列与真核KynU、KynUPA和KynUPF进行比对，以评估相似性，因为较高的序列同一性与结构相似性相关。原核KynU序列与真核KynU共享约30%的同一性，表明存在进化关系。所有分析的细菌都属于变形菌门；因此，KynUBC、KynUCG、KynUPO和KynURP序列与KynUPA显示约70%的同一性，但与KynUPF仅显示40%的相似性。相反，KynUSM序列与KynUPA和KynUPF共享约35%的同一性。然而，相似的蛋白质结构可以共享低至10%的同一性。

TM分数和RMSD值分析表明，原核和真核KynU结构显示较少的相似性。这种结构差异可能反映了远缘同源物和蛋白质进化的变异。与KynUPA和KynUPF结构相比，KynUBC、KynUPO和KynUSM显示与KynUPA和KynUPF的结构相似性，支持功能相似性的可能性。然而，蛋白质表达在构建体kynUBC、kynUCG、kynUHS、kynUPA、kynUPF、kynUPO、kynURP和kynUSM中得到确认，这些构建体用于下游功能评估。

进行功能测定以评估预测的KynU是否可以催化KYN向AA的转化，如对KynUPA所建立的那样。KynUBC、KynURP和KynUSM可以使用KYN作为底物产生AA。这些结果通过LC-MS从那些构建体中检测到细胞外和细胞内AA得到证实，表明AA积累并且也可以通过细菌细胞渗透，可能影响外部环境。在阴性对照和缺乏KYN的情况下未检测到AA，支持酶活性的特异性。

KynU是一种PLP依赖性酶，催化KYN水解为AA和3-HK水解为3-羟基邻氨基苯甲酸。真核KynU优先作用于3-HK，而原核KynU偏好KYN作为底物。KynUHS对3-HK表现出高亲和力（米氏常数/Km~30?μM），但对KYN亲和力低（Km~500?μM），可能解释了在两次生物学试验中从kynUHS中缺乏AA检测的原因。此外，大肠杆菌表达真核蛋白质可能受到错误折叠和缺乏翻译后修饰的阻碍，可能损害蛋白质功能。

构建体kynUCG在三次生物学试验中 consistently 未能产生AA。这种活性的缺乏可能归因于与pBAD-His底盘的不兼容性或特定的环境要求。此外，KynUCG显示与KynUPA和KynUPF的结构不相似性，表明KynUCG可能具有不同的功能。对于构建体kynUPF和kynUPO，在LC-MS分析中产生AA的结果不确定：kynUPF被排除在进一步分析之外，因为它已经充分表征，而kynUPO显示波动结果，无法得出明确结论。

AA是人类和细菌中通过KynU活性产生的中间代谢物。临床上，AA浓度增加与自身免疫性疾病相关，如人类类风湿关节炎和1型糖尿病 mellitus。虽然细菌AA的作用了解较少，但它有助于Rhizobium leguminosarum的铁获取，调节Ralstonia solanacearum的致病性基因，并且是铜绿假单胞菌中PQS合成的前体，影响毒力和免疫逃避。

在人类中，AA也是QA生产的来源，QA是一种已知的神经毒性代谢物。研究口腔细菌AA是否影响人类细胞的QA生产至关重要，以澄清它是否可以将神经活性KYN代谢物的平衡转向神经毒性QA分支，这与神经退行性疾病和神经性疼痛有关。新兴证据表明，口腔微生物群可以通过三叉神经和嗅觉系统的微生物易位与大脑通信，或通过口腔-肠道微生物组相互作用间接触发全身免疫反应，损害血脑屏障，导致神经炎症。因此，证明口腔细菌可以产生KYN代谢物突出了AA在宿主-病原体相互作用中的重要性，并为研究口腔微生物组对口腔-脑轴的影响提供了一个有前景的途径。

除了AA检测外，在所有添加KYN的细菌样品中检测到KYNA，而无论是否添加KYN，培养基中均未检测到。这些结果表明，KYNA可能由大肠杆菌载体中的推定蛋白质使用KYN作为底物产生。大肠杆菌可以表达天冬氨酸氨基转移酶，其与人类KAT在催化KYN转化为KYNA方面具有相似功能。这一发现可能解释了所有含有KYN的条件下KYNA的存在。所选细菌的KynU被确认在QA和PIC生产中无功能，因为两种代谢物均未检测到。

结论

本研究表明，口腔细菌，包括B. cepacia、R. pickettii和S. maltophilia，具有KYN通路，并可以通过其功能性KynU酶将KYN分解代谢为AA。未来的方向包括研究与口腔健康相关的AA的生物学功能，以及阐明AA在细菌中的作用和对口腔微生物组的潜在影响。此外，KYNA在细菌中的生物学重要性需要进一步研究，特别是在口腔细菌中鉴定和表征负责KYNA合成的基因。