基于AlphaFold 3结构预测与功能验证揭示PAX2新型变异致儿童肾发育不良的分子机制

本研究系统分析了10例中国儿童PAX2基因突变导致的肾-眼综合征（Renal-Coloboma Syndrome），通过全外显子测序鉴定出5个新型变异（c.161T>C等），结合AlphaFold 3（AF3）蛋白结构预测（RMSD 1.1-43.6 ?）和HK-2细胞功能实验，证实突变通过破坏PAX2蛋白空间构象（配对结构域/转录激活域）并抑制细胞增殖（PCNA/MCM2/KI67下调），导致肾发育不良（CKD 5期）及新表型（肝纤维化/精索鞘膜积液）。研究强调早期基因诊断和肾脏保护干预对改善预后的重要性。

　　

背景

PAX2基因（OMIM#167409）作为关键转录因子，在肾脏和眼睛等器官发育中起核心作用。该基因位于10号染色体q24.3-q25区，包含12个外显子，其中外显子2-4编码DNA结合关键区域——配对结构域（paired-box domain）。研究表明，PAX2纯合突变小鼠会完全缺失肾脏并致死，而杂合突变则导致输尿管芽分支减少和肾单位数量不足，最终引发肾脏发育异常和功能缺陷。其致病机制主要与强大的抗凋亡活性和促进细胞增殖能力相关。PAX2相关疾病呈常染色体显性遗传，主要表现为肾脏发育不良、肾囊肿、膀胱输尿管反流（VUR）以及视网膜异常等表型。

研究方法

研究团队回顾性分析了2015年1月至2024年10月期间就诊于中山大学附属第一医院儿科风湿肾病中心的10例经全外显子测序（WES）确诊的PAX2突变患儿。通过人类基因变异数据库（HGMD）、LOVD和ClinVar数据库筛选新型变异，并依据ACMG指南进行致病性评估。采用AlphaFold 3（AF3）对野生型和突变型PAX2蛋白进行三维结构预测，通过PyMOL软件计算均方根偏差（RMSD）值量化结构变化（RMSD <2.0 ?视为结构保守）。在功能验证方面，使用人肾近曲小管上皮细胞系HK-2（CRL-2190, ATCC）进行慢病毒转染，通过Western blot检测Flag、PCNA和α-Tubulin蛋白表达，RT-qPCR分析PCNA、MCM2和MKI67 mRNA水平，并采用细胞计数法绘制增殖曲线。

研究结果

临床特征显示10例患儿（男6例，女4例）中位发病年龄为4.2岁（IQR 0-6.5）。所有患者均存在蛋白尿或镜下血尿，9例伴有肾脏发育不良（其中8例为双侧肾发育不良），5例进展至慢性肾脏病5期（CKD 5期），4例接受同种异体肾移植时的平均年龄为10.4±1.0岁。眼部异常见于5例患者，表现为视野缺损、生理盲点扩大及视盘水肿等。此外，研究首次报道了可能与PAX2突变相关的肝功能障碍（ALT 115 U/L，AST 165 U/L伴肝纤维化）和精索鞘膜积液等新表型。

基因分析共发现9种不同的PAX2突变，其中5个为新型变异：c.161T>C（p.Ile54Thr）、c.335G>A（p.Trp112）、c.1230_1238del（p.Thr411_Pro413del）、c.482del（p.Leu161Cysfs5）和c.424_c.427delAAAGinsTTTCAGCAGCC（p.Lys142Leufs^*14）。AF3结构预测显示这些变异引起不同程度的构象破坏：c.161T>C突变导致全局结构严重失真（RMSD 43.6 ?），c.1230_1238del和c.482del分别引起7.0 ?和9.2 ?的全局偏差，而c.335G>A和c.424_c.427delAAAGinsTTTCAGCAGCC虽全局RMSD变化较小（1.1-1.2 ?），但在配对结构域局部产生关键畸变。

功能实验表明，c.335G>A和c.482del变异导致PAX2蛋白截短（分子量分别为13 kDa和31 kDa），c.161T>C和c.335G>A显著降低PCNA蛋白表达。RT-qPCR显示c.161T>C降低PCNA和MCM2 mRNA水平，c.335G>A和c.1230_1238del显著抑制所有增殖标志物（PCNA、MCM2、MKI67）的转录。细胞增殖实验证实所有新型变异均削弱PAX2促进HK-2细胞增殖的能力。

讨论

本研究首次系统报道中国儿童PAX2新型变异的临床与分子特征。AF3结构预测与功能验证的结合，为变异致病机制提供了直观证据：无论是全局结构破坏（如c.161T>C）还是局部构象变化（如c.335G>A），均通过影响DNA结合域或转录激活域功能，最终抑制细胞增殖能力。肝纤维化和精索鞘膜积液的新表型拓展了PAX2相关疾病的表型谱系，但需更多病例验证其相关性。值得注意的是，50%的患者进展至终末期肾病，凸显早期遗传诊断和肾脏保护干预的紧迫性。

结论

本研究通过多组学方法证实5个PAX2新型变异通过结构-功能双重缺陷导致儿童肾发育不良，首次揭示肝纤维化及精索鞘膜积液可能的新表型关联。研究强调对疑似患者应进行全面眼、耳及肝脏评估，并建议将PAX2基因检测纳入儿童慢性肾脏病的常规诊断流程，为早期干预和遗传咨询提供科学依据。