T细胞耗竭相关基因IRF1与PDGFRB调控结肠腺癌免疫浸润并影响预后的机制研究

本研究针对结肠腺癌(COAD)预后分子标志物不足的现状，聚焦T细胞耗竭(TEX)在肿瘤进展中的关键作用。研究人员通过生物信息学分析将432例COAD患者分为C1和C2两种TEX亚型，发现C2亚型具有更高的免疫细胞浸润水平。通过LASSO算法筛选出8个候选预后基因，最终确定IRF1和PDGFRB为独立预后因素：IRF1高表达预示良好预后，PDGFRB高表达则与不良预后相关。构建的IRF1-PDGFRB特征模型对TEX亚型区分效能显著(AUC=0.824)，对COAD诊断价值突出(AUC=0.748)。免疫组化实验验证了IRF1和PDGFRB过表达与TEX标志物增加的相关性。该研究为COAD免疫治疗提供了新的潜在靶点和预后评估工具。

　　

在全球范围内，结肠癌（Colorectal cancer, CRC）的发病率和死亡率一直居高不下，它是男性第三常见、女性第二常见的恶性肿瘤。据2020年统计，全球约有190万新发病例和90万死亡病例，其中结肠腺癌（Colon adenocarcinoma, COAD）作为CRC的主要亚型，占所有癌症的10%左右，是癌症相关死亡的第二大原因。患者常表现为排便习惯改变、慢性腹痛、缺铁性贫血和直肠出血。尽管COAD的中位发病年龄为67岁，但其发病原因尚未完全阐明。值得注意的是，自20世纪90年代以来，美国50岁以下人群的COAD发病率每年增长约2%，这一趋势可能与饮食结构（高加工食品）、肥胖和久坐生活方式相关。

尽管目前有多种治疗手段可用于COAD，但转移仍是导致COAD相关死亡的主要原因。约20%的患者在确诊时已发生转移，50%初始局部肿瘤的患者最终也会发展出转移灶。转移性COAD患者的五年生存率低于20%。手术切除虽是治疗转移性COAD较可靠的方法，但仅适用于少数患者，而化疗会因先天或获得性耐药导致疾病进展。因此，开发更有效的新疗法迫在眉睫。

近年来，肿瘤微环境（Tumor microenvironment, TME）成为癌症研究的热点。TME由细胞外基质（ECM）、成纤维细胞、间充质干细胞（MSCs）、内皮细胞等组成，它们通过外泌体、趋化因子、细胞因子、生长因子等信号分子相互作用，形成网络，使肿瘤细胞能够在TME中存活并抵抗抗肿瘤压力，进而促进免疫抑制、癌症转移、耐药性和异常血管生成。CD8⁺ T淋巴细胞是TME的关键组成部分，在清除肿瘤细胞中发挥重要作用。既往研究表明，CRC中肿瘤浸润CD8⁺ T细胞的高密度与良好预后相关。然而，研究人员逐渐认识到功能失调的CD8⁺ T细胞可能是促进肿瘤细胞逃避免疫监视的关键因素之一，这类细胞后来被称为耗竭T细胞（T cell exhaustion, TEX）。

TEX是一种复杂、发展性和分层性的状态，根据其重编程的转录层次可分为大约4个阶段，只有终止阶段不可逆转且无法重振免疫应答。TEX具有极其复杂的重编程通路网络，针对这一状态的研究为癌症诊断、治疗和预后评估提供了新视角。例如，周等人（Zhou et al.）在30种实体瘤中识别出5种TEX特异性亚型，展示了动态进展过程，揭示了相应TEX亚型的多种免疫微环境，并确定了新的预后标志物。然而，针对结直肠癌特别是COAD的TEX特异性研究仍相对缺乏。

为解决上述问题，研究人员开展了一项针对COAD中TEX的研究，旨在识别TEX特异性预后生物标志物，以改善转移性COAD的不良生存率。本研究基于TEX相关通路（包括肿瘤坏死因子TNF、白介素IL-2、干扰素-γ IFN-γ和细胞毒性通路），利用生物信息学方法对432例COAD患者进行分析，试图揭示TEX在COAD进展中的具体作用机制，并探索新的诊断和治疗靶点。

研究人员从TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库收集了具有表达谱和生存信息的COAD患者数据，将FPKM转换为TPM后进行后续分析。通过ConsensusClusterPlus算法，基于TEX相关通路谱将患者分为两个亚型：C1和C2。进一步采用MCPCounter评估免疫浸润状态，GSEA分析功能差异，并通过LASSO回归筛选候选预后基因。最终，利用免疫组化（IHC）技术在10例COAD患者样本中验证关键基因的表达及其与TEX标志物的关联。

主要技术方法包括：生物信息学聚类分析（ConsensusClusterPlus）、免疫浸润分析（MCPCounter）、差异表达基因筛选（t-test）、功能富集分析（GO和KEGG）、LASCO回归模型构建、单变量和多变量Cox回归分析、受试者工作特征曲线（ROC）评估、单细胞数据分析（TISCH2数据库）以及免疫组化实验（IHC）。样本队列来源于TCGA数据库的432例COAD患者和本机构（南昌大学第二附属医院）收集的10例COAD患者组织样本。

3.1. 基于TEX相关通路的两个COAD患者聚类

通过ConsensusClusterPlus算法，COAD患者被分为两个亚型（C1和C2）。共识矩阵显示，当k=2时，聚类成员资格通过彩色矩形标记，表明分组稳定性。C2亚型相比C1表现出显著更高的10种免疫细胞浸润水平，包括NK细胞、B系细胞、CD8⁺ T细胞、T细胞、细胞毒性淋巴细胞、中性粒细胞、髓样树突状细胞、单核系细胞、内皮细胞和成纤维细胞。GSEA分析进一步揭示，C2亚型与多种免疫调节机制呈正相关，包括“细胞因子-细胞因子受体相互作用”、“自然杀伤细胞介导的细胞毒性”、“趋化因子信号通路”、“Toll样受体信号通路”、“抗原加工和提呈”、“JAK-STAT信号通路”和“细胞粘附分子cams”。这些结果表明，C2亚型具有更活跃的免疫微环境，可能更适合免疫治疗干预。

3.2. C1和C2之间的差异表达基因

两组之间共识别出6306个差异表达基因（DEG），其中24个基因与TEX相关基因重叠，包括PRF1、IRF1、WAS、BTK、B2M、SFMBT2、IRF4、IKZF3、SP140、ZNF521、P2RY8、PDGFRB、CDH11、TCF4、LTB、LOX、ERG、PCDH17、IL7R、TLL1、CR1、ZEB1、CCR7和CD79B。这些基因在C2亚型中均显著上调。GO和KEGG富集分析显示，这24个基因参与多种适应性免疫系统调节，包括淋巴细胞功能调节和活化、淋巴细胞分化、T细胞活化、T细胞分化、基于体细胞重组的适应性免疫应答以及适应性免疫应答的调控。这表明这些基因在TEX和免疫应答中扮演关键角色，可能是COAD免疫治疗的潜在靶点。

3.3. 预后和诊断模型

通过LASSO算法，从24个TEX相关基因中筛选出8个候选预测基因（IRF1、IRF4、SP140、P2RY8、PDGFRB、CDH11、IL7R和TLL1），用于预测COAD患者的无铂间期（PFI）。表达分析显示，IRF4、SP140、P2RY8、IL7R和TLL1在癌组织中下调，而PDGFRB和CDH11上调。ROC曲线分析表明，IRF1和TLL1对COAD具有较高的诊断价值（AUC分别为0.904和0.927），而8基因组合特征显示出极佳的诊断效能（AUC=1.000）。经过SMOTE算法校准后，该模型在测试集中仍保持高准确性。

3.4. 单变量和多变量Cox回归分析

单变量Cox回归分析筛选出IRF1和PDGFRB（P≤0.10）进行多变量分析。多变量Cox回归确定IRF1和PDGFRB为总体生存的独立预后因素（P<0.05）。高IRF1表达与良好生存结局相关（P=0.039），而高PDGFRB表达与较差生存结局相关（P=0.033）。IRF1-PDGFRB特征模型对TEX亚型区分和COAD诊断均表现出良好效能（AUC分别为0.824和0.748）。GSEA分析提示，IRF1与免疫应答和能量代谢相关，如“白细胞凋亡过程的负调控”、“白细胞介素17产生的正调控”和“活性氧生物合成过程”；PDGFRB则与血管生成和形态发生相关，如“循环系统发育”、“血管形态发生”和“脉管系统发育”。这些通路分析揭示了两个基因在COAD进展中的不同生物学功能。

3.5. PDGFRB和IRF1在免疫调节和肿瘤发生中的作用

免疫浸润分析显示，PDGFRB和IRF1高表达与大多数免疫细胞浸润水平呈正相关。具体而言，PDGFRB与NK细胞和巨噬细胞显著正相关，IRF1与树突状细胞（aDC）和细胞毒性细胞显著正相关。单细胞测序表明，IRF1在多种基质细胞（如Treg、CD8⁺ T细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞）中高表达，而PDGFRB主要分布在成纤维细胞和肌成纤维细胞中。两者均与癌症相关成纤维细胞（CAF）浸润呈正相关（IRF1 r=0.268，PDGFRB r=0.931）。进一步相关性分析发现，IRF1表达与多种免疫调节分子（如CXCL9、CXCL10、TIGIT、PDCD1、LAG3、IDO1、CD274、TNFRSF18、TAP1、TAP2、HLA-E、HLA-DRA、HLA-DMA、HLA-DMB和CXCR6）呈正相关；PDGFRB则与KDR、TGFB1、CSF1R、ENTPD1和TNFSF4等免疫抑制剂表达正相关。这些结果提示IRF1和PDGFRB通过调节免疫细胞浸润和免疫检查点分子表达，影响COAD的免疫逃逸和进展。

3.6. IRF1和PDGFRB过表达与COAD样本中T细胞耗竭相关

免疫组化染色显示，在COAD癌组织区域，PD-1、IRF1和PDGFRB信号强烈，而癌旁正常组织仅见微弱和稀疏阳性信号。定量分析证实，癌组织中PD-1、IRF1和PDGFRB蛋白表达量显著升高，表明IRF1和PDGFRB过表达与T细胞耗竭状态相关。这一发现验证了生物信息学分析结果，强调了两者在COAD免疫微环境中的潜在作用。

本研究深入探讨了T细胞耗竭影响胃腺癌预后的可能机制，结果表明TEX相关基因IRF1和PDGFRB可有效预测COAD预后，并有望作为增强免疫治疗疗效的新靶点。IRF1作为干扰素调节因子家族成员，具有肿瘤抑制和免疫监视双重作用：一方面，其缺失或表达减少与多种白血病和肿瘤转移相关；另一方面，它可通过诱导PD-L1表达促进免疫逃逸。PDGFRB则通过促进血管生成和CAF增殖，加速肿瘤转移。两者在免疫浸润、血管生成和基质细胞相互作用中的角色，为COAD的免疫治疗和抗血管生成治疗提供了理论依据。

尽管本研究通过多组学分析和实验验证揭示了IRF1和PDGFRB的预后价值，但仍存在一定局限性。例如，样本量较小（尤其是实验验证部分），且缺乏功能性实验（如基因敲除或过表达）进一步验证机制。未来研究可扩大样本规模，并结合体内外实验探索IRF1和PDGFRB在TEX和免疫治疗应答中的具体作用途径。总体而言，该研究为COAD的精准医疗和免疫治疗策略开发提供了重要线索，具有较高的临床转化潜力。