乳酸菌发酵锦葵叶：一种绿色可持续蛋白质生产新策略

本研究针对植物叶蛋白提取效率低、传统方法易导致蛋白变性等问题，创新性地采用乳酸菌发酵技术从锦葵叶中提取高质量蛋白质。研究人员通过筛选6株乳酸菌菌株进行发酵实验，发现分离自传统发酵乳的植物乳杆菌PQ475926效果最佳，其蛋白质回收率达67.31%，氨基酸总量达396.30 mg/g，显著优于直接乳酸沉淀法。该研究为开发可持续植物蛋白来源提供了环保高效的新方案，对解决全球蛋白质短缺问题具有重要意义。

　　

随着全球人口持续增长，预计到2050年将达到97.3亿，蛋白质需求缺口日益凸显。传统动物蛋白生产面临环境可持续性挑战，包括温室气体排放和资源利用效率低下等问题。在这一背景下，植物叶蛋白作为一种营养全面、可持续的替代蛋白来源受到广泛关注。锦葵叶（Malva sylvestris L.）作为一种野生植物资源，含有丰富的蛋白质和必需氨基酸，其氨基酸组成与肉类、鸡蛋和大豆相似，符合FAO的必需氨基酸模式要求。然而，叶蛋白提取面临细胞壁结构复杂、提取效率低等技术瓶颈，传统热凝固（85°C）和酸沉淀（pH 3.5）方法容易导致蛋白质变性，降低功能特性，且能耗较高。

为解决这些问题，埃及Assiut大学的研究团队在《Applied Food Research》上发表了一项创新研究，探索利用乳酸菌（LAB）发酵技术从锦葵叶中高效提取蛋白质的绿色方法。研究人员采用机械压榨获得锦葵叶绿汁（GJ），经巴氏杀菌后得到澄清汁液（CJ），随后使用6株不同的乳酸菌菌株进行发酵处理，并与直接乳酸沉淀法进行对比评估。

研究采用了多种关键技术方法：乳酸菌发酵技术（使用6株不同LAB菌株）、等电点沉淀法（pH 3.5）、蛋白质回收率计算、氨基酸组成分析（HPLC法）和SDS-PAGE蛋白质电泳分析。所有实验均在39±1°C条件下进行24小时发酵，样本来源于埃及Assiut地区采集的锦葵叶。

3.1. 澄清汁液的乳酸菌发酵

研究人员首先分析了新鲜锦葵叶的化学成分，发现其水分含量为77.50%，干物质基础下的粗蛋白含量达38.28%。通过螺旋压榨，锦葵叶被分离为绿汁（68%）和压榨饼（32%）。绿汁经巴氏杀菌后获得澄清汁液用于后续实验。

在有机乳酸生产方面，所有LAB菌株在39±1°C条件下发酵36小时，乳酸产量存在显著差异。植物乳杆菌PQ475926记录到最高乳酸产率（1.35%），其次为乳酸乳球菌PQ475927（1.07%）。最高产酸量出现在孵育的前24小时内，之后直至36小时无明显增加。

生长曲线分析显示，所有菌株在孵育最初24小时内均表现出显著生长。植物乳杆菌PQ475926和乳酸乳球菌PQ475927记录了最高的生长速率，这可能源于它们能更有效地利用可用糖类。24小时后，细菌开始进入衰亡期，标志着活跃生长的结束。

3.2. 凝固蛋白

pH值在CJ发酵过程中的蛋白质沉淀中起着关键作用。随着LAB产生乳酸，汁液的pH逐渐降低至锦葵叶蛋白的等电点（pI）附近（约3.5）。未发酵CJ对照样品的初始pH为6.6。发酵36小时后，各LAB菌株的pH值分别为：植物乳杆菌DSM20174（4.5）、保加利亚乳杆菌DSM20080（4.7）、干酪乳杆菌DSM20011（4.5）、植物乳杆菌PQ475926（3.6）、戊糖片球菌PQ475928（4.7）和乳酸乳球菌PQ475927（4.0）。植物乳杆菌PQ475926将pH降至最接近理论pI值（3.6 vs pI≈3.5），这与其最高的凝乳蛋白得率78.50%相关，显著优于直接乳酸沉淀的62.6%。

3.3. 蛋白质回收率

蛋白质回收率（PRY）是衡量提取方法效率的关键指标。研究结果显示，不同LAB菌株在PRY方面存在显著差异，这可能是由于酸化速率和代谢副产物的变化所致。乳酸乳球菌PQ475927和植物乳杆菌PQ475926的蛋白质回收率最高，分别达到64.74%和67.31%。植物乳杆菌PQ475926获得最高PRY的原因可能在于其快速酸化能力（pH 3.6），促进了蛋白质沉淀；同时其蛋白酶贡献了部分细胞壁破坏，增加了细胞内蛋白的释放和可及性。相比之下，保加利亚乳杆菌DSM20080表现出最低的PRY（23.1%），这源于酸化能力减弱和乳酸生成减少，阻碍了在理想pI下的蛋白质沉淀。

3.4. 蛋白质的氨基酸组成

氨基酸谱在决定蛋白质整体质量方面起着至关重要的作用。研究人员分析了所有样品中锦葵叶蛋白的氨基酸组成，以确定提取菌株可能带来的差异。

必需氨基酸（EAAs）含量方面，LAB发酵样品的总EAA含量范围从戊糖片球菌PQ475928的179.44±12.45 mg/g到乳酸乳球菌PQ475927的193.69±1.85 mg/g，均高于乳酸沉淀法获得的139.03±0.01 mg/g和大豆蛋白的174.00 mg/g。精氨酸含量在各LAB发酵样品和乳酸沉淀法之间无统计学显著差异，且与大豆蛋白相似。组氨酸含量在LAB发酵样品和乳酸沉淀法之间存在显著差异，LAB发酵样品的组氨酸含量高于大豆蛋白。异亮氨酸和亮氨酸是重要的支链氨基酸，在各样品间无显著差异，且含量与大豆蛋白相似。赖氨酸作为许多植物蛋白中的限制性必需氨基酸，其含量在不同菌株间差异显著，戊糖片球菌PQ475928的赖氨酸含量显著较高，约是大豆蛋白水平的两倍。

非必需氨基酸（NEAAs）含量方面，LAB发酵样品的总NEAA含量范围从戊糖片球菌PQ475928的164.04±8.93 mg/g到植物乳杆菌PQ475926的203±13.60 mg/g，高于乳酸沉淀法获得的112.63±0.24 g/g。除保加利亚乳杆菌DSM20080和戊糖片球菌PQ475928外，所有LAB菌株记录的NEAA含量均高于大豆蛋白。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸在部分LAB发酵样品和乳酸沉淀法之间存在显著差异。

在测试的六株菌株中，植物乳杆菌PQ475926记录了最高的总氨基酸（TAA）浓度，达396.30±6.61 mg/g蛋白质，紧随其后的是乳酸乳球菌PQ475927（393.96±6.61 mg/g）。LAB介导的发酵在释放和保存氨基酸方面效率更高，超过了直接乳酸沉淀的产量（251.66±0.25 mg/g）。

3.5. SDS-PAGE分析

蛋白质电泳分析显示，绿汁（GJ）和澄清汁液（CJ）在10-55 kDa范围内显示出扩散的蛋白条带，表明存在可溶性蛋白组分。GJ和CJ均在55 kDa附近显示出一条显著的高分子量条带，代表完整的锦葵叶蛋白。乳酸沉淀样品显示出55 kDa附近的高分子量条带以及分布在10-35 kDa之间的附加条带，反映了酸化后的部分蛋白质聚集和降解。使用LAB菌株的发酵样品整体表现出更清晰、更强烈的蛋白条带，在45-60 kDa附近和15-25 kDa亚基范围内有突出的蛋白质表达。这些条带明显比对照和乳酸沉淀样品中的更明确，表明LAB发酵促进了选择性回收，导致SDS-PAGE凝胶上的更高溶解度和可见性。

研究结论与意义

该研究证实乳酸菌发酵代表了一种可持续且高效的生物技术方法，适用于绿色植物蛋白提取。乳酸菌能有效产生乳酸，降低pH至等电点（pI）并促进蛋白质沉淀；同时表现出蛋白酶活性，有助于在发酵过程中部分水解蛋白质并释放肽段。生长监测确认所有菌株在24小时内达到指数生长末期，与乳酸产量高峰和pH下降时间一致。在测试的菌株中，从传统发酵乳中分离的植物乳杆菌PQ475926和乳酸乳球菌PQ475927实现了最高的蛋白质回收率和必需氨基酸含量，这通过氨基酸分析和SDS-PAGE得到了验证。菌株间的差异突显了菌株特异性代谢途径对蛋白质产量和质量的影响。

这项研究的重要意义在于：首先，它开发了一种环保的蛋白质提取方法，避免了传统化学提取剂的使用；其次，提高了植物蛋白的提取效率和营养价值，最高蛋白质回收率达67.31%；第三，筛选出了高效菌株植物乳杆菌PQ475926，为工业化应用提供了优质菌种资源；最后，为解决全球蛋白质短缺问题提供了新的技术路径，支持可持续植物蛋白成分在食品和饲料应用中的开发。该技术特别适合资源有限地区，因为锦葵是一种野生植物，不需要特殊栽培管理，且该提取方法不需要复杂设备或昂贵化学品，具有很好的推广前景。