冷大气压等离子体处理对红茶康普茶发酵动力学的影响及其功能性成分调控机制研究

本研究探讨了冷脉冲电晕放电(CD)处理对红茶康普茶发酵过程的调控作用。研究人员通过优化等离子体处理条件（5 kV, 10 kHz, 1 μs脉冲），发现CD处理虽初期降低酵母活性（50.85% vs 73.62%），但能促进细菌代谢活性，加速蔗糖水解和乙酸生成，同时通过HPLC-DAD/GC-MS技术鉴定到6种酚类化合物和24种挥发性成分的变化。重要的是，CD处理后的康普茶在HEK-293细胞系上未显示毒性，证实了等离子体辅助发酵技术在生产功能性饮料中的安全性应用价值。

　　

在传统发酵食品创新与技术融合的探索浪潮中，红茶康普茶（Kombucha）作为一种具有悠久历史的发酵茶饮料，近年来因其潜在的健康益处和功能特性受到广泛关注。它是由红茶汤经过蔗糖添加后，通过细菌和酵母菌共生菌落（SCOBY）发酵而成。发酵过程中，微生物代谢产生多种有机酸、维生素及酚类化合物，赋予康普茶抗氧化、抗炎症和调节肠道健康等功能。然而，传统发酵过程存在发酵周期较长、代谢产物调控精度不足以及功能性成分稳定性不高等问题，制约了其工业化生产和品质提升。

为解决上述问题，研究人员开始探索将新兴物理技术应用于发酵过程，其中冷大气压等离子体（Cold Atmospheric Plasma, CAP）技术因其非热特性、操作灵活性和绿色环保等优势成为研究热点。等离子体技术通过气体电离产生包括活性氧物种（ROS）、活性氮物种（RNS）以及紫外线（UV）在内的多种活性成分，这些成分可显著影响微生物细胞活性和代谢途径，进而调控发酵过程。已有研究报道，CAP技术可用于增强生物乙醇发酵、去除发酵抑制剂以及提高微生物代谢产率，但在康普茶发酵中的应用尚未见系统研究。

在此背景下，由Nahed YOUSFI、Nofel MERBAHI、Jalloul BOUAJILA、Djakaou IYA-SOU、Patricia TAILLANDIER和Mohamed DEBOUBA组成的研究团队在《Applied Food Research》上发表了一项创新性研究，系统分析了冷脉冲电晕放电（Corona Discharge, CD）处理对红茶康普茶发酵动力学、微生物活性、理化特性、酚类化合物组成以及生物活性的影响。该研究不仅深化了对等离子体辅助发酵机制的理解，也为开发高品质功能性饮料提供了新思路。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：使用定制电晕放电反应器（含四个钨电极，曲率半径100 μm）在优化参数（电压5 kV、频率10 kHz、脉冲持续时间1 μs、电极-液面距离7 mm）下处理样品；通过光学发射光谱（OES）分析等离子体气相活性物种；利用细胞计数室和甲基蓝染色进行酵母活菌计数；采用HPLC-RI（高效液相色谱-折射率检测器）定量糖、乙醇和乙酸；通过液相萃取（依次使用乙酸乙酯EtOAc和丁醇BuOH）结合Folin-Ciocalteu法测定总酚含量（TPC）；应用HPLC-DAD和GC-MS技术鉴定酚类及挥发性成分；通过DPPH自由基清除实验评估抗氧化活性（以IC₅₀表示）；并使用MTT法在人体细胞系（CACO-2、LS174T和HEK-293）上评估细胞毒性。

研究结果丰富且多层次，具体如下：

3.1. 等离子体气相表征：光学发射光谱、施加电压和瞬时电流

通过光学发射光谱（200-800 nm）分析，研究人员检测到等离子体中存在的关键活性物种，包括氮分子第二正系（SPS N₂）在337.1 nm的特征峰、氮离子（N₂⁺）在390 nm的峰、一氧化氮（NO）在230-280 nm的发射谱线以及羟基自由基（OH）在309 nm的谱带。可见光区域还观察到氢原子巴尔默系谱线（H_α 656 nm和H_β 486 nm），证实了水分子在等离子作用下的解离。电学特性显示，脉冲放电电流约为0.28 mA，单脉冲放电功率为4 W，能量密度为9.6×10^?4 J/L，这些参数为后续发酵调控提供了能量作用基础。

3.2. 酵母计数

CD处理初期（第0天）降低了酵母存活率（50.85% vs 对照73.62%），这归因于等离子体产生的活性氧物种（如·OH、O₃、¹O₂）对细胞膜、DNA和蛋白质的氧化损伤。然而，从第5天开始，处理组酵母表现出恢复性增长，发酵结束时（第10天）活菌数达到1.74×10⁷ cells/mL，与对照组（1.73×10⁷ cells/mL）无显著差异。这表明酵母通过激活抗氧化酶（如Sod1p、Sod2p、Ctt1p）和应激信号通路（如MAPK级联）实现了适应性响应。

3.3. 理化参数评估

所有样品在发酵过程中pH均从4.2降至3.4，主要源于微生物代谢产生的有机酸（如乙酸、葡萄糖酸）。电导率则从0.8 mS/cm升高至1.1 mS/cm，反映了离子成分的变化。CD处理未显著改变这些趋势，但促进了蔗糖水解和乙酸生成，表明细菌代谢活性被特异性增强。

3.4. 糖、乙醇和乙酸含量变化

CD处理加速了蔗糖水解和葡萄糖消耗，但未显著影响果糖代谢。乙酸产量在处理组中更高（最终差异约0.5 g/L），而乙醇产量在两组间无显著差异（最终约4.5 g/L）。这表明CD处理改变了微生物代谢平衡，倾向于促进细菌（乙酸菌）代谢而非酵母发酵。

3.5. 康普茶提取物的化学组成与生物活性

3.5.1. 提取率与总酚含量定量

液相萃取显示，水相提取率最高（80.0 g/L），乙酸乙酯相最低（1.7-5.1 g/L）。CD处理使未发酵茶的EtOAc提取物总酚含量（TPC）从246 mg GAE/g DW升高至399.3 mg GAE/g DW，但发酵后处理组的TPC（176.2 mg GAE/g DW）低于未处理组（283 mg GAE/g DW）。这表明等离子体同时具有增强酚类提取和促进氧化的双重作用，发酵过程中微生物对酚类的生物降解是含量下降主因。

3.5.2. 酚类化合物鉴定

HPLC-DAD分析鉴定出6种酚类化合物，包括三羟乙基芦丁、芦丁、儿茶素、5-羟基-3′-甲氧基黄酮、黄嘌呤酸和迷迭香酸。其中儿茶素和芦丁在发酵后含量降低，提示微生物代谢作用；CD处理增加了芦丁和三羟乙基芦丁的稳定性，可能与它们的糖苷化结构有关。

3.5.3. 气相色谱-质谱分析

GC-MS在衍生化前后共鉴定出24种挥发性成分，包括有机酸（如草酸二丙酯）、醛类（如丁醛缩二丁醇）、烷烃（1-二十烷醇）、芳香化合物（咪唑并[1,5-a]吡啶-3-苯基）、生物碱（咖啡因）以及糖类衍生物（如葡萄糖、奎尼酸）。CD处理后检测到1-[4-(1-羟乙基)苯基]-3,3-二甲基三氮烯等新化合物，表明等离子体引发了分子结构改性。

3.5.4. 抗氧化活性变化

DPPH实验显示，EtOAc提取物具有最强抗氧化能力（抑制率90-98%）。CD处理使发酵茶的IC₅₀从7.6 μg/mL增至16.3 μg/mL，证实抗氧化活性因酚类降解而降低，但未发酵茶不受影响。

3.5.5. 体外细胞毒性评估

在50 μg/mL浓度下，所有提取物对癌细系（CACO-2、LS174T）仅显示中度抑制（<50%），而对正常肾细胞HEK-293未表现毒性。CD处理降低了有机提取物的细胞毒性，但增强了水相提取物的抑制效果，提示等离子体可能激活了亲水性生物活性分子。

研究结论部分强调，CD处理通过调控微生物活性和代谢途径，增强了康普茶发酵效率（特别是蔗糖水解和乙酸生成），但同时促进了酚类化合物的生物降解，导致抗氧化活性降低。等离子体处理未引入毒性风险（HEK-293实验证实），且产生的稳定氮物种（NO₂^?、NO₃^?）浓度低于欧盟饮用水指令限值。这一研究不仅证明了等离子体辅助发酵在功能性饮料生产中的可行性，还揭示了其在促进有机物生物降解方面的潜力，为后续工业应用提供了重要依据。

讨论中进一步指出，该技术仍需优化以平衡功能性成分保留与发酵增强效应，建议未来研究聚焦于等离子体参数精细化、长期储存稳定性评估以及消费者接受度调查。总体而言，这项研究为传统发酵食品创新提供了一种绿色、高效的技术路径，具有显著的科研价值和应用前景。