β-内酰胺耐药性进化导致适应性代价与交叉敏感性：流感嗜血杆菌的实验室进化研究

本研究通过体外多步进化实验，揭示了流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）在β-内酰胺抗生素压力下的耐药进化机制。研究发现耐药性主要由ftsI（编码PBP3）和ompP2基因突变驱动，并伴随显著的适应性代价（fitness cost）和广泛的交叉敏感性（collateral sensitivity），尤其对氨基糖苷类、大环内酯类和多黏菌素类药物敏感性增加。该研究为理解耐药进化路径的预测性和制定针对耐药菌的交替治疗策略提供了关键实验依据。

　　

ABSTRACT

抗菌药物耐药性（AMR）的进化是全球健康威胁，其进化轨迹是否导致可预测的表型尚不明确。本研究通过控制进化实验，分析了人类病原体流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）在氨苄青霉素、头孢噻肟或头孢曲松浓度递增条件下的耐药进化。从六个独立实验的不同时间点分离出315个克隆，表征其基因组序列变化、细菌适应度以及对14种抗生素的最小抑菌浓度（MICs）。研究发现，氨苄青霉素和头孢噻肟压力下的耐药进化主要由编码青霉素结合蛋白3的ftsI基因突变驱动，而头孢曲松暴露则反复选择了外膜蛋白P2（OmpP2）的氨基酸替换。部分OmpP2突变体不仅对头孢曲松表现出表型异质性，还对氟喹诺酮类、利福平和四环素表现出异质性。细菌适应度评估揭示了耐药相关突变与生长之间的权衡关系，但未检测到MIC增加与生长缺陷的系统性相关性。超过50%的克隆对氨基糖苷类、克拉霉素和黏菌素的敏感性增加，而某些突变模式导致对美罗培南和氟喹诺酮类的交叉耐药。总体而言，β-内酰胺抗生素可重复地选择MIC增加的突变体，但进化路径和最终表型仍不可预测。这些发现凸显了耐药进化的复杂性，提示未来AMR治疗策略需更密切考虑菌株特异性和交叉效应。

INTRODUCTION

抗菌药物耐药性（AMR）是全球重大公共卫生挑战。世界卫生组织已将氨苄青霉素耐药流感嗜血杆菌菌株列为重点病原体。流感嗜血杆菌是常见的革兰阴性机会性病原体，定植于人类上呼吸道，可引发从窦炎和中耳炎等轻症到脑膜炎和菌血症等侵袭性疾病。尽管针对b型流感嗜血杆菌的疫苗已成功实施，但无荚膜菌株（NTHi）日益普遍，并在许多地区进化出对氨苄青霉素和阿莫西林等氨基青霉素的耐药性。虽然阿莫西林-克拉维酸和氨苄青霉素-舒巴坦在全球用于克服β-内酰胺酶介导的耐药性（主要是TEM-1和ROB-1），但头孢噻肟和头孢曲松等第三代头孢菌素也能有效绕过这些酶，因其良好的耐受性和高血清及脑脊液浓度，越来越受临床青睐，尤其适用于治疗由流感嗜血杆菌引起的败血症和脑膜炎等严重感染。然而，耐药性也可通过编码青霉素结合蛋白3（PBP3）的ftsI基因的改变，在β-内酰胺酶阴性菌株中进化。ftsI突变，尤其是PBP3转肽酶结构域中的突变，会降低对不同β-内酰胺抗生素的结合亲和力。目前关于流感嗜血杆菌的耐药进化在不同β-内酰胺类别中是否遵循相同的遗传和表型轨迹，以及此类进化路径是否可重复，理解有限。实验室进化实验为解决这些问题提供了有力方法。通过体外模拟选择压力，这些实验可以追踪耐药进化过程中的遗传变化和表型适应，并有助于评估进化出的交叉效应，如交叉耐药或交叉敏感性（即对某些抗生素具有进化耐药性的变异体对其他抗生素的敏感性增加），这可能为 epistatic 相互作用提供信息，并可能为耐药菌株制定新的治疗方案。因此，本研究旨在增强对耐药进化可预测性及由此产生的交叉效应的理解。

MATERIALS AND METHODS

Bacteria and culture methods

β-内酰胺酶阴性参考菌株流感嗜血杆菌Rd KW20和进化突变株常规在巧克力琼脂上于37°C、含5% CO₂的湿润气氛中从-80°C冻存液复苏培养。巧克力琼脂上生长的菌落作为接种物，用于在Haemophilus试验培养基（HTM）中进行液体培养，于37°C、100或200 rpm振荡培养。液体培养物常规铺板于HTM琼脂。

Antibiotic susceptibility testing

为确定多步进化实验的抗生素起始浓度，使用HTM肉汤微量稀释法检测参考菌株对氨苄青霉素、头孢噻肟和头孢曲松的MICs。对所有进化分离的单克隆，常规使用梯度扩散条（Liofilchem MIC Test Strips）测定氨苄青霉素、头孢噻肟和头孢曲松的MICs。为检查交叉效应，额外测试了17个克隆对克拉霉素、卡那霉素、黏菌素、万古霉素、左氧氟沙星、利福平、阿米卡星、四环素、庆大霉素和美罗培南的敏感性。根据EUCAST折点（v.13.0 2023）进行敏感性判读。

Multi-step evolution experiment

将敏感参考菌株流感嗜血杆菌Rd KW20的群体在HTM中置于抗生素压力（氨苄青霉素、头孢噻肟和头孢曲松）下进化，起始抗生素浓度为参考菌株MIC的0.5倍。一个群体在无任何抗生素压力下进化（对照）。在头孢曲松存在下的进化进行了三次以研究耐药进化的可重复性。使用单菌落重悬液接种2 mL培养物。进化的2 mL培养物在12孔微孔板中于37°C、100 rpm和5% CO₂下每周期培养4天，每天进行100倍稀释至2 mL新鲜HTM中。在每个传代中，一个培养物在与前一次传代相同的抗生素浓度下生长（备用培养物），同时接种三个含有前一次传代两倍抗生素浓度的额外培养物。只要较高抗生素浓度的培养物中至少有一个在24小时后显示可见生长，就使用该培养物接种下一次传代。这种方法允许在整个实验中逐步增加抗生素浓度而不导致灭绝。支持可见生长的最高抗生素浓度记录为最终浓度。在每个4天周期结束时，将20 μL培养物点种于巧克力琼脂上。该过程重复总共五个周期，累计20次液体培养基传代。最终周期不点种巧克力琼脂，直接处理。每个传代的甘油库存（HTM含20%甘油）储存于-80°C。通过稀释划线从各自甘油库存中分离单克隆。通常每个传代分离两个克隆，但当抗生素浓度较前一次传代增加时，分离五个克隆。分离的克隆在3 mL HTM中生长，以使用梯度扩散条测定氨苄青霉素、头孢噻肟和头孢曲松的MICs，并使用DNeasy UltraClean Microbial Kit分离DNA用于测序。

Whole genome sequencing

从提取的基因组DNA制备短读长DNA文库，在Illumina NextSeq 2000上测序。短读长数据可在欧洲核苷酸档案库（ENA）获取。通过参考序列比对流程调用突变（SNPs、短插入和缺失）。使用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）将短读长比对至参考基因组，使用Genome Analysis Toolkit进行等位基因调用。使用PacBio Sequel II系统对选定克隆进行长读长测序，以识别结构基因组变化。使用PacBio SMRTlink软件进行从头基因组组装。每个组装与参考基因组比对，从比对中提取检测到的变异。手动检查所有315个克隆的BWA比对文件，以寻找ompP2的变异。

Phylogenetic and Bayesian analysis

使用FastTree计算每个进化实验的系统发育树。使用FigTree进行中点根定，使用iTol进行可视化。首先使用TempEst通过采样天数与根到尖距离的相关性评估系统发育分子钟信号。使用lmPerm R包进行基于置换的线性回归分析以检验回归模型的显著性。使用BEAST计算所有进化实验的突变率（一个头孢曲松暴露的重复实验除外）。采用溯祖指数种群模型、对数正态时钟速率、严格分子钟、尖端定年（实验天数）、GTR替代模型、2000万次迭代、10% burn-in、每2000次迹/树采样。使用Tracer检查BEAST日志文件。

Competitive growth assay

进行成对竞争生长试验以估计进化突变体与亲本菌株相比的体外相对适应度。所选克隆代表多样的突变模式。简要而言，五个单菌落作为3 mL预培养物的接种物，生长至中期指数期。预培养物稀释至OD₆₀₀约0.025。将等体积（1.5 mL）稀释的突变体和亲本菌株培养物加入15 mL Falcon管中。共培养物一式三份，于37°C、200 rpm振荡培养4小时。通过标准平板计数测定初始和最终菌落形成单位（CFU）。使用公式fitness_m = ln(A_{m, 4h}/A_{m, 0h}) / ln(A_{r, 4h}/A_{r, 0h})计算相对于亲本菌株的适应度。

Crystal structures

从RCSB蛋白质数据库获取流感嗜血杆菌PBP3转肽酶结构域（氨基酸254–610）的晶体结构。使用PyMOL可视化检测到的PBP3替换。使用结核分枝杆菌和金黄色葡萄球菌PBP3的晶体结构叠加氨苄青霉素和头孢噻肟。从AlphaFold蛋白质结构数据库获取全长PBP3的结构。使用AlphaFold Server预测野生型和突变外膜蛋白P2（OmpP2）的结构，使用PyMOL可视化。

Statistical analyses

使用Mann-Whitney U检验分析特定突变与敏感性降低之间的关联。比较两组进化克隆的氨苄青霉素、头孢噻肟和头孢曲松MIC值。两组克隆仅在研究的突变或突变组合上存在遗传差异。使用Benjamini-Hochberg校正调整P值以最小化多重检验导致的假阳性风险。使用单样本t检验（考虑Malthusian参数）评估突变体与参考菌株相比适应度增益/损失的显著性，并进行Benjamini-Hochberg多重检验校正。进行成对t检验以识别同一进化群体中分离的克隆适应度值之间的显著差异。进行置换检验以评估平均适应度与对氨苄青霉素、头孢噻肟和头孢曲松的抗菌敏感性（MIC）之间的关联。

RESULTS

Evolution of beta-lactam resistance is mainly driven by ftsI and ompP2 mutations

将参考菌株流感嗜血杆菌Rd KW20置于多步进化实验中，暴露于浓度递增的三种β-内酰胺抗生素（氨苄青霉素、头孢噻肟和头孢曲松）。细菌群体在个体实验中进化超过20次传代，相当于约200代。总体研究了315个克隆的基因组和MICs，这些克隆从六个独立进化实验的不同时间点分离，包括一个无药对照和三个头孢曲松重复实验。在20天的指数生长中，个体实验识别出11至25个突变（包括SNPs和indels），导致突变数量随时间线性增加。基于SNP的系统发育和根到尖线性回归表明，除一个头孢曲松暴露的重复实验外，所有进化实验中恒定分子钟的支持度为中度至强。基于贝叶斯溯祖模型，突变率范围为1.0×10^-7至2.1×10^-7 substitutions per site per day。无药对照实验中，单个克隆对三种β-内酰胺抗生素的MICs未发生显著变化，测量的MIC差异在技术变异范围内。在进化的对照群体中未检测到主要药物靶点ftsI的任何突变。相反，暴露于氨苄青霉素、头孢噻肟和头孢曲松导致β-内酰胺MICs显著增加。特别是头孢曲松暴露导致强烈的MIC增加；在一个克隆中，相对于祖先菌株，头孢曲松的MIC增加高达64倍。氨苄青霉素暴露导致对所有三种β-内酰胺抗生素的MIC增加较为温和。此外，暴露于第三代头孢菌素的群体对头孢曲松和头孢噻肟的MIC增加比氨苄青霉素更显著。针对头孢噻肟（EUCAST折点：>0.125 mg/L）的临床耐药在55个克隆中有4个（7.3%）被观察到，这些克隆是在头孢噻肟暴露下进化的；在三个头孢曲松进化实验中进化的169个克隆中有28个（16.6%）被观察到。头孢曲松暴露进一步选择了169个克隆中的1个（0.6%）头孢曲松耐药（EUCAST折点：>0.125 mg/L）克隆和10个（5.9%）氨苄青霉素耐药（EUCAST折点：>1 mg/L）克隆。对氨苄青霉素和头孢噻肟的交叉耐药在五个头孢曲松暴露下进化的克隆中被观察到。总体而言，20天的氨苄青霉素暴露未选择出对任何三种测试药物临床耐药的克隆。正如预期，β-内酰胺抗生素MIC的增加与ftsI突变相关。在136个显示至少一个ftsI突变的进化克隆中，18个根据EUCAST折点对头孢噻肟耐药，但无一对氨苄青霉素或头孢曲松耐药。具体而言，我们在转肽酶结构域中识别出以下五种氨基酸替换的组合：p.Thr332Ile (c.968C>T), p.Thr443Ala (c.1327A>G), p.Ala530Ser (c.1591G>T), p.Asp551Tyr (c.1652G>T), 和 p.Ala561Glu (c.1684C>A)。氨苄青霉素和头孢噻肟暴露均选择了p.Ala530Ser。在头孢噻肟条件下，p.Ala530Ser、p.Thr443Ala和p.Thr332Ile逐步进化。p.Asp551Tyr和p.Ala561Glu替换在头孢曲松暴露的一个群体中独立检测到，各自同时出现（在第三次传代检测到）。检测到的ftsI突变与β-内酰胺MIC增加显著相关。在PBP3晶体结构模型中，所有五个ftsI突变要么靠近其他众所周知的耐药相关氨基酸位置（Ile449, Arg517, 和 Asn526），要么靠近抗生素结合位点。此外，ftsI突变差异性地影响对氨苄青霉素、头孢噻肟和头孢曲松的敏感性。虽然我们观察到与氨基酸替换p.Ala530Ser相关的氨苄青霉素（两倍增加）和头孢曲松（三倍增加）MIC显著增加，但次级氨基酸替换p.Thr443Ala未显著影响氨苄青霉素敏感性，但与头孢噻肟MIC两倍增加相关。在五个检测到的PBP3替换中，p.Asp551Tyr对所有三种β-内酰胺显示出最高的MIC倍数增加，头孢曲松MIC最大增加八倍。令人惊讶的是，从头孢曲松暴露群体（重复1和3）分离的克隆不携带任何ftsI突变。然而，我们反复选择了ompP2中的不同突变，即p.Thr126fs (c.376_377insT), p.Val353fs (g.902541_902708del), 以及一个包含从密码子353开始的基因组倒位的结构重排，导致p.Gly354fs (g.902541_902708inv)。后两个突变未通过短读长参考序列比对方法检测到，但基于长读长组装被识别。然而，通过手动检查BWA比对，这两个突变也可在无长读长测序数据的克隆中检测到。此外，使用长读长测序数据可检测到不同基因中的各种串联重复变异。突变p.Thr126fs在ompP2中位置129引入终止密码子，导致蛋白质截短至仅128个氨基酸（而非359个氨基酸）。其他两个起始于密码子353的突变影响OmpP2的C末端，特别是β-桶的最后一条β-链。所有三个ompP2突变与所有三种β-内酰胺抗生素的MIC增加显著相关，对头孢曲松敏感性的影响更显著。总体而言，315个进化克隆中有104个携带ompP2突变，其中10个对氨苄青霉素耐药，14个对头孢噻肟耐药，1个对头孢曲松耐药。然而，所有具有ompP2突变的耐药克隆还携带其他突变。仅具有ompP2突变的克隆显示出高度增加的MICs，但低于各自的EUCAST临床折点。有趣的是，携带导致p.Gly354fs的倒位突变（g.902541_902708inv）的菌株在β-内酰胺敏感性方面表现出表型异质性。这些菌株在梯度扩散条琼脂平板上对所有三种β-内酰胺显示两个椭圆。较低的MIC对应于亲本菌株观察到的MIC ± 两个倍比稀释。除了ftsI和ompP2突变，我们在有和没有预先存在的ftsI或ompP2突变的克隆中检测到pnp（编码多核糖核苷酸核苷酸转移酶）中的13种不同突变，这些克隆从头孢噻肟暴露群体以及两个头孢曲松重复实验下分离。其中7个诱导提前终止密码子，3个导致移码，3个是非同义SNPs。p.Glu220*和p.Glu580fs与在具有OmpP2 p.Thr126fs的克隆中所有三种β-内酰胺的MIC显著增加相关。由于携带特定突变模式的克隆数量不足，无法确定pnp中其他检测到的突变的效果。在氨苄青霉素和头孢曲松（重复2）暴露群体分离的克隆中检测到rpoB（编码DNA指导的RNA聚合酶亚基β）中的四种不同突变，其中三个位置接近。此外，从氨苄青霉素、头孢噻肟和头孢曲松（重复2）暴露群体衍生的克隆在udk（编码尿苷激酶）和spoT（编码鸟苷-3',5'-双(二磷酸) 3'-焦磷酸水解酶）中进化出四种不同突变。在氨苄青霉素暴露克隆中检测到prs（编码核糖磷酸焦磷酸激酶）中的两个突变，以及在头孢曲松暴露克隆（重复1和3）中检测到Rd_08000（编码一个推定的TonB依赖性受体）中的两个突变。然而，仅观察到微小效应，对于ftsI和ompP2以外的基因突变，最大中位MIC倍数增加为3。

Evolved resistant mutants pay a fitness cost under drug-free conditions

为调查特定突变体的可能适应度代价并识别最小化耐药相关突变施加的适应度代价的推定补偿突变，进行了竞争生长试验。大多数进化克隆表现出比亲本菌株更低的适应度，强烈表明在无抗生素情况下耐药与竞争适应度之间存在进化权衡。然而，三个菌株未显示适应度/生长缺陷。其中一个克隆携带推定的降低β-内酰胺敏感性的ftsI和rpoB突变，并伴随udk突变。另一个克隆显示相同的突变模式，但具有rpoA、plsB和prs的额外突变。进行成对t检验以比较给定进化实验中的所有克隆。特别有趣的是比较仅相差一个突变的克隆，因为这允许评估特定遗传背景中个体突变的适应度效应。E_1Amp_17a和E_1Amp_13a的适应度测定结果比较显示，在各自的突变背景中，rpoA突变恢复了野生型适应度水平。克隆E_0.032Ctx_07a展示推定的降低β-内酰胺敏感性的ftsI和pnp突变，并伴随突变的plsB。在这种情况下，与E_0.016Ctx_05b的适应度测定结果比较显示，plsB突变的进化在各自的突变背景中导致野生型适应度。此外，适应度降低可直接归因并量化于ftsI (p.Asp551Tyr)、ompP2 (p.Thr126fs和p.Val353fs)、和pnp (p.Glu580fs和p.Glu220*)中的特定突变。进化克隆的MIC增加与相对适应度的相关性揭示，对于头孢噻肟，MIC与适应度呈负相关，但对于氨苄青霉素和头孢曲松，MICs与适应度无相关性。

Evolved beta-lactam resistance is commonly associated with collateral sensitivity toward aminoglycosides, clarithromycin, vancomycin, and colistin

为评估交叉效应的表达，我们表征了从进化实验中分离的17个克隆对来自不同类别的14种抗生素的耐药性。我们识别出对β-内酰胺抗生素敏感性降低的一致模式。这还包括碳青霉烯美罗培南的MIC增加。在这种情况下，两个对氨苄青霉素、头孢噻肟和头孢曲松MIC增加的克隆表达了对美罗培南的交叉耐药，超过EUCAST折点水平。令人惊讶的是，两个在头孢曲松暴露下进化的克隆表现出对美罗培南的敏感性增加（即交叉敏感性）。这两个克隆还显示出对所有非β-内酰胺抗生素的交叉敏感性，四环素除外。通常，交叉敏感性最常针对三种考虑的氨基糖苷药物（阿米卡星、卡那霉素和庆大霉素）、大环内酯克拉霉素以及多黏菌素药物黏菌素表达，可能表明在流感嗜血杆菌β-内酰胺耐药进化中交叉敏感性的稳健出现。此外，两个识别的表型异质性OmpP2突变体对多种抗生素一致表达表型异质性，包括除β-内酰胺外的氟喹诺酮类、利福平和四环素。

DISCUSSION

本研究表征了机会性人类病原体流感嗜血杆菌对三种临床相关β-内酰胺抗菌药物的体外耐药进化。我们的结果显示突变数量随时间近似线性增加，而对抗生素的敏感性在早期传代下降更陡峭，并在后期传代趋于稳定，动态变化因不同β-内酰胺和重复实验而异。这些耐药性增加主要由先前表征的抗菌药物耐药基因突变介导，并在两个群体中与表型异质性的出现相关。通常，对一个抗生素的进化耐药导致在无药环境中显著的适应度降低，并引起对其他药物类别的表型反应改变，包括许多交叉敏感性案例，尤其是对氨基糖苷类和额外药物类别。理解进化路径并预测其对未来治疗方案的影响对于减少细菌适应和抗菌药物耐药性选择至关重要。

呼吸道流感嗜血杆菌感染通常使用氨基青霉素与β-内酰胺酶抑制剂联合治疗（以克服β-内酰胺酶介导的耐药性）。在治疗失败或败血症、脑膜炎等严重侵袭性感染的情况下，推荐使用头孢噻肟和头孢曲松等第三代头孢菌素。然而，头孢菌素耐药是否可以通过除众所周知的PBP3 III组突变之外的替代进化路径发展仍不清楚。此外，虽然头孢曲松和头孢噻肟耐药在当前临床分离株中罕见，但理解潜在的进化路径和交叉效应对于预测未来威胁和优化治疗策略至关重要。

为此，我们通过将流感嗜血杆菌Rd KW20暴露于浓度递增的氨苄青霉素、头孢噻肟和头孢曲松进行体外进化实验，并监测基因组变化。除p.Thr322Ile外，本实验中识别的所有PBP3替换先前均有报道（与其他氨基酸替换组合）于患者来源的分离株，并表现出对头孢菌素和/或氨苄青霉素的敏感性降低。值得注意的是，尽管p.Arg517His和p.Asn526Lys是氨苄青霉素和头孢噻肟耐药的两个众所周知的驱动突变，但进化实验中未进化出任何PBP3氨苄青霉素耐药组定义突变。然而，在头孢噻肟暴露下进化的PBP3 p.Thr322Ile和p.Thr443Ala在空间上分别靠近Asn526和Arg517。有趣的是，PBP3β-内酰胺结合位点的 resulting 结构变化似乎主要影响对头孢菌素而非氨苄青霉素的耐药性。在Jakubu等人进行的NTHi体外进化实验中，一个具有野生型ftsI的菌株在头孢菌素头孢呋辛存在下进化出p.Thr443Ala。与我们的结果一致，相应群体仅显示头孢菌素的MIC增加，而非氨苄青霉素。因此，头孢菌素可以选择不影响氨苄青霉素敏感性的氨基酸替换。

然而，我们也观察到在氨苄青霉素和头孢噻肟选择压力下p.Ala530Ser的趋同进化。相应的克隆显示出显著增加的MICs，特别是氨苄青霉素和头孢曲松，证明PBP3中的氨基酸替换可以对β-内酰胺抗生素显示交叉效应。进一步研究阐明特定ftsI突变和突变模式在多大程度上影响第三代头孢菌素敏感性以及治疗结果信息对于评估这一点和改进临床决策至关重要。

有趣的是，我们还观察到具有高度增加β-内酰胺MICs但不携带任何ftsI突变的克隆。头孢曲松暴露导致三种不同ompP2突变的进化，对所有三种β-内酰胺抗生素的MICs产生深远影响。OmpP2是流感嗜血杆菌中主要外膜蛋白之一，功能为孔蛋白，排除限约1.4 kDa。分析流感嗜血杆菌ompP2基因的研究报告了构建β-桶的16条β-链的高度保守性，但八个表面暴露环区变异增加和SNPs积累，这可导致抗原变异。通过在大肠杆菌acrB和ompF敲除菌株中表达流感嗜血杆菌的OmpP2和AcrAB（多药外排泵）编码基因，Zwarma等人提供证据表明流感嗜血杆菌对β-内酰胺的敏感性实际上受OmpP2影响。虽然外排泵AcrAB-TolC主动将抗生素从细胞质和周质转运出细胞，但OmpP2通过将药物泄漏回细胞来平衡这种外排。

我们的发现证实，ompP2中的多样突变可显著促进流感嗜血杆菌中高度增加的β-内酰胺MICs。这些ompP2突变似乎在头孢曲松暴露下被特别选择。本研究中检测到的ompP2移码突变p.Thr126fs在氨基酸位置129（而非位置361）引入终止密码子，因此可能产生无功能蛋白质。另外两个导致p.Val353fs（缺失）和p.Gly354fs（倒位）的突变仅影响孔素的最后一条β-链，尽管AlphaFold预测突变序列不改变β-桶结构。因此，β-内酰胺抗生素的流入减少可能源于由于改变的氨基酸残基特性导致孔道内静电谱的改变。大多数关于流感嗜血杆菌β-内酰胺耐药的研究集中于PBP3，这使得评估ompP2突变的临床相关性及其对治疗失败的贡献变得困难。

其他对氨苄青霉素、头孢噻肟和/或头