RB-TnSeq揭示了β-变形菌中针对二元羧酸的特异性代谢途径，从而提升了塑料单体的循环利用效率

《Applied and Environmental Microbiology》：RB-TnSeq elucidates dicarboxylic-acid-specific catabolism in β-proteobacteria for improved plastic monomer upcycling

本研究通过随机条形码转座子测序（RB-TnSeq）筛选出四种β-蛋白酶杆菌（B. phytofirmans, C. basilensis, P. bryophila, R. CL21）能以中长链二羧酸为唯一碳源生长，并发现其代谢二羧酸与脂肪酸的基因功能显著不同。针对R. CL21，敲除两个转录调控因子后构建的工程菌株（R2xKO）可高效利用短链（C5-C7）二羧酸，并成功从混合二羧酸（模拟塑料降解产物）中生产靛蓝胭脂烯，产量达0.56 g/L，验证了其作为塑料回用产物的潜力。

　　在当今全球面临塑料污染和环境挑战的背景下，微生物对塑料废弃物的利用和转化已成为重要的研究领域。塑料的大量生产和使用，尤其是自二战以来，导致了全球约83亿吨的塑料产量，这些塑料大多来源于化石燃料。因此，寻找替代的处理方法和可持续的生物生产方式显得尤为重要。本研究聚焦于二羧酸代谢，这些化合物不仅在工业中扮演关键角色，如塑料和聚合物的合成原料，同时也是塑料降解过程中可能产生的产物。通过随机条形码转座子测序（RB-TnSeq）技术，我们生成了一个全面的数据集，用于分析二羧酸和脂肪酸代谢的遗传基础。研究结果显示，二羧酸和脂肪酸的代谢在基因层面存在显著差异，不同的β-氧化基因集合被发现对同链长的二羧酸和脂肪酸的降解具有不同的作用。此外，我们还识别了与二羧酸利用相关的转录调控因子和转运蛋白，这些发现为构建高效的代谢工程路径提供了宝贵的资源。

RB-TnSeq是一种强大的高通量技术，它允许快速地对特定选择条件下个体基因的适应性进行全基因组分析。在本研究中，我们利用这一技术分析了四个β-变形菌（β-proteobacteria）的适应性，这些菌株在二羧酸作为唯一碳源的情况下表现出良好的生长能力。通过对比不同碳源的适应性数据，我们发现这些菌株在二羧酸代谢中具有显著的基因表达差异。其中，Ralstonia sp. UNC404CL21Col（R. CL21）的适应性数据尤为引人注目，因为其在多种链长的二羧酸上表现出优异的代谢能力。通过删除两个转录调控因子，我们成功地提升了R. CL21对短链二羧酸的利用效率，这一结果为后续的塑料废物回收提供了重要依据。

为了验证R. CL21在塑料废物回收中的潜力，我们进一步测试了其对模拟混合二羧酸的利用能力，这些二羧酸是聚乙烯氧化过程中产生的。通过引入一个异源的靛蓝素合成路径，我们成功地将这些二羧酸转化为靛蓝素，产量达到0.56 ± 0.02 g/L。靛蓝素是一种来源于三羧酸循环（TCA cycle）中间体的非核糖体多肽合成酶（NRPS）产物，这一结果表明R. CL21在将塑料废物转化为高附加值产品方面具有巨大潜力。此外，我们还发现R. CL21在不同二羧酸混合物中的代谢能力远优于野生型菌株，这表明其具有较强的代谢灵活性和适应性。

在研究过程中，我们还识别了多个与二羧酸代谢相关的转运蛋白和调控因子。这些基因的适应性数据表明，它们在不同链长的二羧酸代谢中扮演着重要角色。例如，R. CL21中存在多个保守的二羧酸转运系统，这些系统对不同链长的二羧酸具有特异性。同时，我们也发现了一些调控因子，它们在二羧酸代谢中具有显著的适应性变化。通过比较不同链长二羧酸的适应性数据，我们进一步揭示了这些基因在代谢路径中的作用。此外，我们还分析了这些基因的序列相似性和功能相关性，发现某些基因在不同菌株中具有相似的适应性特征，而另一些则表现出显著的差异。

在探索R. CL21作为塑料废物回收的潜在宿主时，我们不仅关注其代谢能力，还致力于构建适用于该菌株的工程工具包。我们测试了多个启动子和抗生素筛选系统，发现R. CL21对多种抗生素具有天然抗性，如卡那霉素和链霉素。这为后续的基因工程提供了便利，因为这些抗生素可以用于筛选和维持工程菌株。此外，我们还发现了一些具有诱导能力的启动子系统，这些系统能够有效调控目标基因的表达，为构建高效的代谢路径提供了可能。

通过综合分析RB-TnSeq数据，我们发现二羧酸代谢和脂肪酸代谢在基因层面存在显著差异。这些差异不仅体现在代谢路径的不同，还体现在基因的适应性表现上。例如，某些基因在二羧酸代谢中表现出强烈的适应性变化，而在脂肪酸代谢中则无显著影响。这表明，二羧酸代谢可能需要一组独立的β-氧化基因集合，这些基因在脂肪酸代谢中并未被充分研究或应用。此外，我们还发现了一些基因在不同链长的二羧酸代谢中具有不同的适应性表现，这提示了代谢路径的复杂性和多样性。

本研究的结果不仅为理解二羧酸代谢的遗传基础提供了新的视角，还为开发新的代谢工程路径提供了重要参考。通过构建一个能够高效利用多种链长二羧酸的菌株，我们展示了R. CL21在塑料废物回收中的应用潜力。同时，我们还验证了该菌株在将二羧酸转化为高附加值产品方面的能力，这为未来的研究提供了新的方向。例如，通过进一步的代谢工程，可以探索R. CL21在生产其他来源于TCA循环中间体的生物产品方面的潜力，如生物燃料等。

总之，本研究通过系统分析二羧酸代谢的遗传基础，揭示了不同菌株在代谢路径上的差异和适应性表现。这些发现不仅有助于理解微生物代谢的复杂性，还为开发新的生物技术提供了重要的数据支持和理论依据。通过构建高效的工程菌株和工具包，我们展示了R. CL21在塑料废物回收和高附加值产品生产中的应用前景，这为解决塑料污染和环境问题提供了新的思路和方法。