酸性生物成因石膏的微生物生态学：富硫化氢洞穴中新形成与残留硫酸盐沉积物上的极端微生物群落结构与分布

本研究深入探索了意大利Frasassi洞穴系统中酸性硫酸盐沉积物的微生物生态，揭示了硫化氢（H2S）氧化驱动的硫酸盐沉积过程中极端微生物（如Acidithiobacillus、Thermoplasmatales古菌）的群落演替规律，为火星硫酸盐沉积环境（如Gale crater）的宜居性及生命探测提供了关键的地球化学与微生物学类比依据。

　　

ABSTRACT

硫酸盐矿物在火星表面广泛分布，许多蒸发岩沉积被认为是从酸性流体中沉淀形成的。在地球上，石膏（CaSO₄•2H₂O）和其他硫酸盐有时在酸性条件下形成，因此探索这些矿物环境中存在的极端微生物生命有助于评估酸性硫酸盐沉积环境的天体生物学潜力。本研究通过16S rRNA基因测序和细胞计数，对洞穴中全新形成和残留沉积物上的石膏相关微生物群落进行了表征，以测试微生物群落组成和丰度如何随距离硫化氢水层的远近以及洞穴空气中H₂S(g)和其他气体浓度的变化而变化。研究发现，在洞穴下层 actively forming 的石膏上定殖的群落多样性较低，且细胞数量少于洞穴中的其他环境。最丰富的类群是Acidithiobacillus、Metallibacterium、Mycobacteria和三种不同的Thermoplasmatales古菌，它们根据距离硫化溪流的远近和洞穴空气中气体浓度的不同占据不同的生态位。相比之下，较老洞穴层位中的沉积物拥有更多样化的群落，这些群落与全新形成石膏上的群落不同，可能代表了依赖不同能量资源的群落。这些发现表明，酸性硫酸盐沉积物是极端微生物的栖息地，并拓宽了我们对与陆地硫酸盐相关生命的认识。

IMPORTANCE

石膏和其他硫酸盐在火星上很常见，这些沉积物中有许多被认为是在火星历史早期由酸性流体形成的。因此，了解在地球类似环境中生存和繁衍的生命对于评估这些火星硫酸盐是否或曾经是否宜居至关重要。酸性石膏出现的一个此类环境是硫酸洞穴，其中极端微生物通过氧化洞穴空气中的硫化氢气体驱动硫酸盐矿物的沉淀。本研究对Frasassi洞穴中全新形成和古老石膏上的微生物群落进行了表征，发现石膏沉积物承载的微生物群落随着化学能量可用性和石膏年龄的变化而变化。我们的发现强调了化学和微生物相互作用在塑造宜居生态位中的重要性，并为在火星酸性硫酸盐中寻找过去或现在的生命提供了背景。

INTRODUCTION

石膏（CaSO₄•2H₂O）和其他硫酸盐矿物在火星上很普遍，包括正在被好奇号探测器访问的Gale crater地层。由于它们与地球上的水生条件和极端微生物生命相关，硫酸盐矿物代表了过去潜在的宜居环境，这些蒸发岩沉积被认为是生命探测任务的目标。许多火星水合硫酸盐被认为是在酸性条件下形成的，火星上酸性流体形成硫酸盐矿物的广泛证据包括Terra Sirenum的Cross crater地层、Meridiana Planum和Gale crater。在地球上，微生物生命在极端、石膏沉淀环境中很丰富，例如低pH值的干盐湖和盐滩、酸性热泉和受火山影响的沉积物以及酸性矿山排水。在极端环境中，石膏晶体可以保护石内微生物，甚至可能是生物可利用水的来源。酸性石膏沉积物可以保存休眠细胞和生命化石证据，甚至可能超过很长的时间尺度。因此，地球上的酸性石膏沉积物是火星硫酸盐的宝贵化学类比物，可以帮助理解微生物如何利用这些矿物环境，并揭示硫酸盐中留下的生物信号的命运。

酸性石膏也在地下的硫化洞穴中形成。硫化洞穴通过一个称为硫酸洞穴成因（SAS）的过程发展，其中含有溶解硫化氢（H₂S）的缺氧地下水在洞穴水层处或附近暴露于氧气。硫化氧化微生物在这个混合区繁衍，并催化H₂S氧化为元素硫和硫酸。这既发生在水层以下的洞穴溪流和湖泊中，也发生在地下水位以上的洞穴壁和天花板上，在那里H₂S脱气进入洞穴大气。在地下水位以上，微晶石膏形成壁壳，其中硫酸腐蚀亚空中石灰岩表面，有时被称为“置换溶液”或“石膏置换”过程（SO₄^2? + 2H⁺ + CaCO₃ + H₂O → CaSO₄•2H₂O + CO₂）。随着SAS的进展，这种次生石膏在洞穴壁和天花板表面积累，最终脱落并作为崩塌沉积物堆积在洞穴地板上。除非与新鲜表面滴水或其他洞穴水接触而溶解，这些“残留”石膏沉积物可能会持续延长的时间尺度，甚至在新墨西哥Guadalupe山脉现已不活动的SAS洞穴中长达12 Ma。

意大利的Grotte di Frasassi（Frasassi洞穴）是一个活跃的硫化洞穴系统，可以观察到这些过程。SAS发生在H₂S富含地下水出现在现代水层的地方，新的石膏壳在湍流、脱气溪流附近沉淀。下层全新形成的石膏极度酸性（pH <2），具有牙膏状的微晶质地，有时带有较大的透明石膏晶体。紧靠脱气溪流上方，石膏通常与极度酸性的微生物生物膜相关联，称为“snottites”，尽管石膏壳在发现snottites的区域之外发展。

残留石膏沉积物可达几米厚，可以在较老的通道中找到，这些通道比当前水层高10到100米。这些区域通过构造抬升和Sentino河的切割逐渐远离硫化含水层的影响，形成一系列亚水平的多层位，记录了追溯到早更新世和中更新世的历史SAS过程。由于这些残留石膏沉积物不再暴露于脱气的H₂S，任何微生物必须依赖其他且可能更有限的能量资源。古老的SAS洞穴通常是贫营养的，定殖在洞穴沉积物和其他矿物表面的现存微生物的能量来源可能包括微量气体、基岩中的微量矿物质和有机输入。

因此，像Frasassi这样的活跃硫化洞穴中的石膏可能为了解地下环境中硫酸盐矿物相关微生物群落提供独特的见解，其中初级生产是由微生物化能自养驱动的。Frasassi洞穴特别有价值，因为与大多数硫化洞穴不同，它们在同一个系统中包含全新形成和残留的石膏沉积物，这为评估不同年龄沉积物上的硫酸盐相关群落提供了机会。然而，虽然形成酸性“snottite”生物膜的微生物群落已得到充分研究，但对次生石膏本身的微生物群落知之甚少。此外，尚未确定这些沉积物在残留硫化洞穴中作为微生物栖息地持续多长时间。因此，我们对整个Frasassi洞穴中石膏沉积物相关的微生物群落进行了采样，以（i）表征 actively forming 石膏中微生物群落的结构和组成，以及（ii）比较全新石膏上的微生物群落与上层洞穴较老石膏沉积物上的群落。我们假设靠近硫化水层的石膏上的群落将由与已知硫化氧化化能自养菌和其他嗜酸菌相关的类群主导，并且这些群体会随着远离水层而逐渐消失，并在较老洞穴层位的残留石膏中缺失。我们通过使用高通量16S rRNA基因测序和细胞计数来测试这些假设，以评估微生物群落组成和丰度如何随距离硫化水层的远近以及洞穴空气中H₂S(g)和其他气体浓度的变化而变化。

RESULTS

Sample collection and field observations

我们从下层 actively forming 的洞穴层位以及较老上层的残留沉积物中的多个地点采样了石膏表面。在下层，我们从三个不同的有硫化溪流的通道采集了石膏：Ramo Sulfureo (RS)、Pozzo dei Cristalli (PC)和Grotta Bella (GB)。在这些位置，我们从H₂S(g)浓度高达33 ppmv（体积百万分比）的紧靠溪流上方的区域采集了样品，到距离溪流超过30米、H₂S(g)检测不到的区域。靠近硫化溪流的石膏壳始终酸性（pH ≤2），并且通常是亚空中表面上潮湿的、牙膏状的涂层。在RS地点，小晶体元素硫（S°）与石膏一起出现。我们还从Grotta del Fiume (GdF)入口路线沿线的地板和墙壁采集了一些样品，该路线通往PC但距离最近的脱气溪流超过25米，在那里H₂S通过气味或便携式气体采样设备检测不到。GdF中以及PC和GB地点更远离溪流的石膏沉积物通常是干燥和粉状的，pH通常无法用pH试纸在野外测量。CO₂浓度范围从靠近溪流的800到4,600 ppmv到GdF通道中低至700 ppmv，其他气体（NH₃、SO₂和CO）低于检测限。完整的样品信息和相关地球化学数据在补充表S1中提供。

在上层较老层位，我们从Sala della Sabbia (SDS)和第五岩溶层位上的“Site TP” (TP)的巨大崩塌沉积物中采样了石膏，这些地方可通过技术性洞穴路线在Grotta Grande del Vento的展示洞穴部分进入。这些通道比当前水层高30多米，形成于距今超过100 Ka以前；SDS沉积物坐落于一个河流沙之上，该沙的年代在129到101 Ka之间，与同一层位洞穴沉积物的U-Th日期大致一致，而TP沉积物采样的层位形成于大约200 Ka。在这些区域，H₂S通过气味检测不到。这些石膏沉积物干燥易碎。SDS沉积物由一个较低的灰色层（碎屑沉积物与石膏混合）和一个巨大的上层白色层组成，而TP的沉积物是白色的，但比SDS的白色层更不均匀，较大的粉红色和米色透明石膏晶体与粉状白色微晶石膏混合。我们还从Grotta del Bugianardo（BG地点）采集了样品，这是一个以前硫化的洞穴，年龄未知，位于Sentino河对面。BG的石膏沉积物出现在壁袋中，作为崩塌物，干燥，类似于GdF通道中的石膏。在这些区域，H₂S检测不到，CO₂浓度为800-1100 ppmv。

Small subunit rRNA gene amplicon libraries

我们生成了107个成功的16S rRNA基因文库，其中大多数（n = 85）来自下层通道GB、PC和RS。经过质量过滤和移除小文库后，文库范围从10,139到87,767条序列，平均文库大小为40,245（标准差20,056）。总体而言，来自上层通道的文库有更多的OTU，并且比下层通道的文库更多样化。

在层次聚合聚类分析中，来自这些通道的大多数样品分成三个主要簇（簇II、III和IV），而来自GdF、BG以及来自SDS和TP的上层沉积物的大多数样品（n = 28）聚集在一起（簇I）。因此，簇I中的文库似乎代表了与残留石膏沉积物相关的群落，而簇II-IV中的文库代表了全新形成或至少仍在 actively forming 的石膏上的微生物群落。

六个OTU在簇II-IV中持续存在：Acidithiobacillus (OTU 1)、Metallibacterium (OTU 3)、Mycobacterium (OTU 6)和三个Thermoplasmatales古菌（OTU 2, Ferroplasma； OTU 4, Cuniculiplasma； 和 OTU 5, 一个未培养的Thermoplasmatales）。Acidithiobacillus在簇III和IV中最丰富，而Metallibacterium在簇II中最丰富，Mycobacterium在簇IV中最丰富。在古菌中，Ferroplasma在簇IV中最丰富，而其他两个Thermoplasmatales OTU在一些簇II和IV文库中最丰富。OTU 5（未命名的Thermoplasmatales成员）的代表性序列与来自Frasassi snottite样品的16S rRNA基因克隆RS05_24c_A14 (HM754549)具有100%的一致性，该克隆被分类为“D-plasma”的成员。这个OTU在簇II中最丰富。

簇I比其他三个簇更多样化，由Proteobacteria的OTU主导，还有一些来自Actinomycetota、Acidobacteriota和Cyanobacteria的OTU，并包括一些未命名的类群，如“Gammaproteobacteria PLTA13”和门“WPS-2”。簇I还包括多个过程空白，它们在簇I内一个较小的簇中聚集在一起，因此该子簇中的样品（在图中用星号[*]表示）从后续分析中移除。

Relationships between microbial community composition, geochemical variables, and cave location

来自大多数下层样品的文库在非度量多维尺度（NMDS）排序中聚集在一起，并且与上层文库簇在统计上显著不同（ANOSIM, R = 0.83, P < 0.001; PERMANOVA, F = 12.9, P < 0.001）。当仅对簇II-IV中的文库进行排序时，环境叠加显示距离硫化溪流的距离以及洞穴空气中H₂S(g)和CO₂(g)浓度与排序在统计上显著相关（距离：R² = 0.23, P < 0.001； H₂S：R² = 0.09, P = 0.029； CO₂：R² = 0.17, P < 0.001）。距离与第一个排序轴对齐，方向与H₂S(g)和CO₂(g)浓度相反，与硫化溪流作为这些气体的来源一致。最丰富类群的物种得分显示，Acidithiobacillus (OTU 1)、Ferroplasma (OTU 2)和Mycobacterium (OTU 6)在簇III和IV中丰富，并与靠近硫化溪流、具有高H₂S(g)和CO₂(g)浓度的样品相关。相比之下，Metallibacterium (OTU 3)和未分类的Thermoplasmatales (OTU 5, 可能为D-plasma)与簇III和增加的距离硫化溪流的距离相关，而Cuniculiplasma (OTU 4)同时出现在簇II和IV中。

因此，我们检查了这些主要类群与来自PC、GB、RS和GdF的所有样品中相应变量之间的具体关系，我们能够测量这些样品距离硫化溪流的距离。所有Acidithiobacillus OTU的相对丰度随着距离硫化物来源的距离而减少（Pearson’s R = ?0.26, P = 0.003; Spearman’s ρ = ?0.33, P = 0.003），尽管这是可变的，并且在距离溪流10米以内的样品中范围从>90%到0%。同样，Thermoplasmatales群古菌在靠近溪流的地方最丰富，但这种趋势在统计上不显著（Pearson’s R = 0.069, P = 0.53; Spearman’s ρ = 0.09, P = 0.4）。虽然Ferroplasma和Cuniculiplasma都出现在靠近水层的样品中，但Ferroplasma在具有高H₂S(g)浓度的样品中更丰富，而Cuniculiplasma主要出现在具有低-检测不到H₂S(g)的样品中。

Cell counts

距离硫化溪流10米以内的石膏表面的细胞计数在3.4 × 10⁷和7.2 × 10⁸ cells g^?1之间。然而，进一步远离溪流，细胞计数变化更大，低至6.3 × 10⁶ cells g^?1，高至1.4 × 10¹⁰ cells g^?1。总体而言，来自较老层位的石膏表面具有更高的细胞丰度，在3.2 × 10⁸和3.3 × 10⁹ cells g^?1之间。

DISCUSSION

Microbial communities from actively forming gypsum deposits

本研究的第一个目标是表征 actively forming 洞穴石膏中的微生物组合，并评估群落如何随着远离硫化水层而变化。虽然许多先前的研究集中在snottite生物膜上，但据我们所知，唯一描述了全新形成SAS石膏上微生物群落的研究来自一个受海水影响的硫化洞穴。D’Angeli等人发现Thermoplasma和其他Thermoplasmatales群古菌丰富，细菌类群如Acidithiobacillus、Metallibacterium和Sulfobacillus的数量较低，其中一些也已知来自硫化洞穴snottites。因此，我们预计Frasassi中 actively forming 石膏上的微生物群落将包含许多与Frasassi snottites中已知的相同生物，并且这些群落将随着远离脱气硫化溪流而变化，在那里H₂S(g)通量较低，因此可用的化学能量较少。

在所有下层通道（RS、PC和GB）的全新石膏中持续丰富的类群是Acidithiobacillus、Metallibacterium、Mycobacterium和Thermoplasmatales群古菌。我们将这种微生物组合解释为与 actively forming SAS石膏相关的群落的指示。基于层次聚合聚类分析和NMDS排序，最靠近水层、H₂S(g)通量最高的石膏群落由Acidithiobacillus、Ferroplasma和Mycobacterium主导。更远（但仍在下层 actively forming）的石膏有更多的Metallibacterium和其他Thermoplasmatales。极端嗜酸古菌之间似乎存在生态位分离，Ferroplasma持续更丰富于暴露于高H₂S(g)浓度的样品中，而Cuniculiplasma出现在具有低H₂S(g)且更远离溪流的样品中。

其中四个类群与已知的硫化氧化化能自养菌相关。基于先前在同一洞穴中的宏基因组分析，来自Frasassi的Cuniculiplasma具有硫化物醌还原酶（SQR）但似乎不编码其他氧化还原无机硫化合物的酶，而Ferroplasma具有更完整的硫化物氧化途径，包括SQR和硫加氧酶还原酶（SOR）。同样，Acidithiobacillus thiooxidans是众所周知的硫化氧化剂，基于培养和宏基因组分析表明，来自Frasassi snottites的Acidithiobacillus thiooxidans分离株是专性化能自养菌，编码SQR和部分Sox系统。基于Metallibacterium分离株以及来自另一个硫化洞穴的Metallibacterium spp.的宏基因组分析，Frasassi中石膏相关的Metallibacterium可能也能够氧化一些还原无机硫化合物。因此，石膏相关群落中最丰富的四个成员（Acidithiobacillus、Metallibacterium、Ferroplasma和Cuniculiplasma）可能能够进行硫化氧化，并可能直接促进洞穴中硫酸生产和石膏形成。至于其他两个最丰富的成员，据我们所知，没有D-plasma的基因组数据可用，并且Mycobacterium spp.已在其他富硫洞穴的亚空中表面上发现，它们似乎是甲烷氧化菌或有机营养菌。未来的组学或基于培养的分析将有必要进一步探索这些石膏相关种群的代谢能力。

石膏表面上的许多生物，特别是Acidithiobacillus、Ferroplasma和Cuniculiplasma（以前称为G-plasma），在同一洞穴的snottite生物膜中也很丰富。然而，Acidithiobacillus在snottites中比在石膏中丰富得多。基于先前使用荧光原位杂交（FISH）对来自Frasassi的16个snottite样品的研究，Acidithiobacillus平均占总细胞的68.6%，有时是检测到的唯一微生物，而古菌平均占总细胞的18.2%，最多为38.6%。相比之下，我们在这里发现Acidithiobacillus平均占 actively forming 石膏中16S rRNA基因的29.6%，而Thermoplasmatales群古菌占19.8%。Acidithiobacillus spp.在snottites中相对较高的比例与Acidithiobacillus可能是主要snottite形成生物的迹象一致，因此在生物膜中比在石膏表面上更丰富。

从洞穴石膏中提取DNA具有挑战性。在先前对Frasassi石膏的实验中，Havlena等人表明，在提取前溶解石膏并不能改善DNA回收。总体而言，石膏的细胞远少于其他洞穴沉积物，例如生物蠕变，其细胞数高达10¹¹ cells g^?1，因此石膏的低DNA回收可能是低微生物生物量的结果。此外，在样品收集后，这些分子可能在全新石膏的氧化、酸性条件下迅速降解。

Relict gypsum surfaces

本研究的第二个目标是评估微生物是否以及如何继续在较老、残留的石膏沉积物中使用石膏作为栖息地。来自上层巨大石膏崩塌沉积物的微生物群落与下层活跃层位大多数沉积物上的群落不同。所有来自GdF、BG和上层较老层位（SDS和TP）的成功文库与来自PC和GB中远离水层的沉积物的一些文库聚集在一起。这些文库不包含超过1%的与全新石膏表面相关的六个最丰富OTU，而是包含更多样化的微生物群落，具有与有机营养生活方式相关的属，如Brevibacillus和Lactobacillus，以及其他种群，如最近被确定为甲烷氧化菌的gammaproteobacterial类群“wb1-P19”，以及可能的无机氮氧化剂属，如crenarchaeon“Candidatus Nitrosotalea”。然而，令人惊讶的是，这些较老的沉积物比全新 forming 石膏具有更高的细胞数量，这可能反映了较老沉积物酸性较低的矿物基质。此外，残留石膏沉积物 presumably 比全新 forming 石膏更不动态，因此细胞可能有更多时间在较老沉积物的表面积累。未来的工作应解决这些较老石膏沉积物上的细胞是活跃、休眠还是死亡，以及这些沉积物是否包含石内微生物或只是表面相关群落。此外，硫化洞穴石膏有时可以使用U-Th方法直接定年，这可以改善这些较老沉积物的年龄约束。

这些独特的微生物组合可能反映了石膏表面群落的不同能量资源。Frasassi的上层目前不暴露于来自硫化水层的H₂S(g)，并且石膏仅保留在受表面滴水保护的地方，因此石膏表面的微生物必须依赖气流中的微量气体或颗粒物质。Frasassi也是意大利最受欢迎的展示洞穴之一，每年有超过25万游客到访上层，因此来自游客的物质可能影响这些群落。然而，来自展示洞穴部分SDS和TP地点的文库与来自BG、GdF、PC和GB的残留石膏沉积物的文库相似，这些地方不是展示洞穴的一部分，其中一些只能通过技术性洞穴路线进入。因此，这些群落可能代表了其他洞穴中较老石膏典型的微生物群落类型。未来使用宏基因组学或其他组学的研究可以解决与残留石膏沉积物相关的微生物群落的代谢景观。

Astrobiological implications

探索这些石膏相关群落及其分布增强了我们对生命如何在具有类似咸性和酸性条件的其他行星体上发展和被检测的理解。Frasassi洞穴是一个特殊的环境，可以探索适应酸性、硫酸盐沉淀环境的 subsurface 微生物生命，既在石膏 actively forming 时，也在上层洞穴层位中随时间干燥的残留沉积物中。此外，由于其地下位置，这些沉积物不应包含光合生命，并且与表面的有机物质隔离，因此Frasassi中的极端微生物群落提供了一个潜在的窗口，让我们了解光合作用从未进化过的世界。我们在这里表明，Frasassi中全新 forming 的石膏被低生物量的嗜酸细菌和古菌群落定殖，这些微生物可能利用洞穴大气中的无机化学能，并且似乎基于能量可用性组织在生态位中，反映了洞穴生态系统内能量资源的空间变异性。相比之下，较老的沉积物具有不同的微生物群落，可能覆盖了原始的石膏相关群落。

尚未确定SAS石膏是否以及如何忠实地保存与全新 forming 石膏相关的化学合成群落的生物信号。Frasassi中 actively forming 的石膏包含微生物H₂S氧化的同位素特征，它和其他硫化洞穴包含其他潜在的形态、矿物和同位素生物信号。研究还表明，其他酸性环境中的石膏沉积物包含形态生物信号和完整细胞。当存在多条生物信号线时，陆地类比地点最稳健，这对于任何外行星环境都是必要的，先前的研究使用显微镜、光谱和化学技术来表征其他石膏环境中的石内微生物和相关分子特征。然而，尚不清楚洞穴石膏沉积物是否在石膏可以在硫酸洞穴中持续数十万到数百万年的时间内保存分子生物信号，并且到目前为止，尚未报道与 actively forming 或残留硫化洞穴石膏相关的有机生物标志物。我们鉴定出的几个在 actively forming 石膏上最丰富的类群能够产生对天体生物学研究有价值的脂质生物标志物。来自硫化洞穴snottites的Acidithiobacillus spp.和Thermoplasmatales已被证明分别产生细菌藿烷多醇（BHPs）和甘油二烷基甘油四醚（GDGTs），我们假设这里鉴定的石膏相关Acidithiobacillus和古菌也是如此。基于Acidithiobacillus和Thermoplasmatales的丰富性，这些分子类别中的任何一个对于评估酸性石膏中有机生物标志物的保存都将是有价值的。然而，Frasassi中与残留石膏相关的独特群落的存在也表明，如果生物标志物没有被捕获在崩塌沉积物内，最初的石膏沉淀联盟可能会被覆盖。

MATERIALS AND METHODS

Sample collection

本研究的样品于2019年7月、2021年10月和2022年7月采集。使用无菌工具采样石膏，通常通过在同一壁位置50厘米内采集三重样品。用于DNA提取的等分试样立即保存在RNAlater中，在运输过程中存储在-20°C或冰上，返回NMT地球生物学实验室后存储在-80°C。用于显微镜检查的等分试样在采集后12-16小时内用4% PFA固定。

在采样时，使用手持式测量仪记录H₂S、O₂、SO₂、NH₃、CO、LEL和CO₂的浓度，有时对于H₂S、CO₂和SO₂，使用Dr?ger管。H₂S(g)在超过20 ppmv时会干扰ENMET Sapphire上的NH₃检测器，因此我们仅报告H₂S低于10 ppmv区域的数据。低层位地点潮湿石膏的pH使用试