淡水池塘富集的耐酸亚硝酸盐氧化硝化螺旋菌NS4的基因组学与生理特性解析及其在酸性环境氮循环中的生态意义

本研究成功从淡水池塘沉积物中富集并鉴定出一株新型耐酸亚硝酸盐氧化细菌（NOB），命名为NS4，系统发育归属于Nitrospira属的lineage II（Nitrospira_D）。通过整合生理实验与基因组分析，揭示其在高酸性环境（最适pH 6.0）下通过高底物亲和力（Km(app) = 4.02 μM）、完整的还原性TCA循环与耐酸相关基因（如分子伴侣、转运蛋白等）实现生态适应。该研究提出将其命名为“Candidatus Nitrospira acidotolerans”，为理解酸性生态系统中氮循环机制及NOB的多样性提供了关键依据。

　　

引言

氮循环是全球生物地球化学过程的核心环节，其中好氧硝化作用包括氨氧化和亚硝酸盐氧化两个关键步骤。近年来，Nitrospira属细菌因其代谢多样性——包括完成全程氨氧化（comammox）以及利用尿素或氢代谢——而备受关注。然而，由于生长缓慢、环境丰度低和培养难度大，亚硝酸盐氧化细菌（NOB）在酸性环境中的存活策略与适应性机制仍知之甚少。本研究旨在通过富集培养、生理特性研究与基因组分析，揭示耐酸NOB的生态适应机制。

材料与方法

富集与分离

研究样本取自韩国济州岛Namsaengi池塘沉积物（pH 5.5–6.0），使用人工淡水（AFW）培养基，以0.1 mM亚硝酸盐为唯一能源，在26°C黑暗静置条件下进行富集。通过连续传代和稀释至灭绝法获得高度富集的NS4培养物。利用特异性引物扩增nxrB基因并构建克隆文库，证实培养物中仅存在一种Nitrospira相关序列。

生长实验与定量分析

通过定量PCR（qPCR）监测16S rRNA基因拷贝数以评估NS4的生长动态。在不同pH（5–9）和亚硝酸盐浓度（0–0.7 mM）条件下测定亚硝酸盐氧化速率，确定最适生长条件。

动力学参数测定

采用光纤氧传感技术测量氧气消耗速率，通过Michaelis-Menten模型计算亚硝酸盐氧化的动力学常数（K_m(app)和V_max）。

基因组测序与分析

通过宏基因组测序、组装和分箱获得高质量宏基因组组装基因组（MAG），使用CheckM2评估完整度和污染率，通过GTDB-Tk进行物种分类，利用Prokka、Roary和anvi’o进行基因注释和比较基因组分析。

结果与讨论

耐酸亚硝酸盐氧化菌的富集

NS4培养物在pH 5.0–6.0条件下表现出稳定的亚硝酸盐氧化活性，最适pH为6.0，最适亚硝酸盐浓度为0.5 mM。克隆文库与系统发育分析表明，该培养物中的优势NOB属于Nitrospira_D谱系，与Nitrospira lenta BS10的16S rRNA基因相似性达99%。

亚硝酸盐氧化动力学

NS4培养物的最大生长速率（μ_max）为0.62 day^?1，其对亚硝酸盐的表观亲和力极高（K_m(app) = 4.02 μM），优于多数已报道的Nitrospira菌株（如N. moscoviensis的K_m = 9 μM）。此外，其氧气亲和力（K_m(app) = 46.4 μM）表明其适应低氧环境的能力。

基因组特征与系统发育

NS4基因组大小为3.67 Mbp，GC含量59.69%，编码3,555个CDS和50个RNA基因。系统发育与平均核苷酸一致性（ANI < 95%）分析支持其为一新物种，提议命名为“Candidatus Nitrospira acidotolerans”。功能注释显示，基因富集于细胞壁/膜生物合成、能量转化、信号转导和分子伴侣等类别，与酸性环境适应相关。

核心代谢与能量代谢

NS4基因组编码完整的亚硝酸盐氧化酶（nxrAB）、还原性TCA循环关键酶（如柠檬酸合酶、ATP依赖性柠檬酸裂解酶）以及高亲和力末端氧化酶（如cytochrome cbb₃型氧化酶），证实其化能无机自养生活方式。未检测到Calvin-Benson-Bassham循环相关基因。

辅助代谢潜能

NS4具备氰酸水解酶（cynS）、铵转运蛋白（Amt）和谷氨酰胺合成酶（glnA）等基因，支持其氨同化能力。但缺乏尿素利用相关基因（如ureC），且未观察到有机底物下的异养生长。此外，其携带糖原合成与降解通路基因，但可能仅在特定条件下激活。

耐酸机制与共生依赖

NS4基因组编码多种耐酸相关基因，包括钾转运系统（kdpABCDE）、ABC转运蛋白（如铁、硫酸盐、磷酸盐转运系统）、分子伴侣（dnaK、groEL等）和抗氧化酶（超氧化物歧化酶）。然而，缺乏典型的pH稳态系统（如Na⁺/H⁺逆向转运蛋白）。值得注意的是，NS4缺乏完整的钴胺素（维生素B₁₂）合成途径，暗示其可能依赖共生微生物提供这一必需辅因子，符合“黑皇后假说”的代谢依赖策略。

基因组可塑性与比较基因组学

比较基因组分析显示，Nitrospira属细菌具有高度基因组可塑性，核心基因比例极低。重组事件分析表明，重组对遗传变异的贡献高于点突变（重组/突变比≈1.8），这可能是其代谢多样性与环境适应性的重要驱动因素。

结论

本研究通过多学科方法成功富集并表征了一株新型耐酸亚硝酸盐氧化细菌“Ca. Nitrospira acidotolerans” NS4。其在低pH条件下的高底物亲和力、独特的遗传适应机制（如耐酸基因 repertoire）以及潜在的共生依赖关系，深化了我们对酸性环境中氮循环微生物生态学的理解。该研究为探索极端环境下NOB的多样性、适应性及生态功能提供了重要理论依据。