基于三代测序的海南类鼻疽伯克霍尔德菌地方株基因组研究与SHERLOCK检测技术构建

本推荐研究采用三代测序（TGS）技术解析海南类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei, Bp）地方株全基因组结构，并创新性构建基于CRISPR/Cas13a的SHERLOCK检测技术。该技术整合重组酶聚合酶扩增（RPA）与侧流层析技术，实现1–2小时内高灵敏度（100%）、高特异性（100%）的快速检测，为类鼻疽病的早期诊断提供新策略。

　　

ABSTRACT

类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei, Bp）是一种存在于土壤和地表水中的革兰氏阴性杆菌，可引起人和动物的类鼻疽病。本研究旨在利用三代测序（third-generation sequencing, TGS）技术获取海南地方性Bp菌株的全基因组序列，阐明其基因组结构、功能及遗传进化特征，并基于特异性高灵敏度酶促报告解锁（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking, SHERLOCK）检测技术实现对这些地方株的快速特异性鉴定，为类鼻疽病的早期诊断提供新策略。

通过PacBio平台完成16株海南Bp菌株的全基因组测序，经质量控制与基因组组装获得高精度完整序列。同时建立的SHERLOCK核酸检测技术平台，从核酸提取到结果判读仅需1–2小时，表现出良好的灵敏度与特异性（均为100%）。侧流层析试纸条法无需特殊设备，有望成为类鼻疽病即时筛查的有效手段。

IMPORTANCE

类鼻疽病是由Bp引起的高致病性传染病，传统诊断金标准仍为临床样本的分离培养，该方法特异性高但灵敏度低、耗时长，易导致漏误诊。本研究结合重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）技术与成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）/Cas13a技术，建立SHERLOCK检测方法，可实现Bp的快速精准鉴定，为类鼻疽病早期诊断提供新方法。

INTRODUCTION

Bp广泛分布于热带和亚热带地区的土壤与水体，尤其在澳大利亚北部和东南亚地区流行。基因组研究表明，澳大利亚与亚洲菌株存在显著遗传差异，澳大利亚可能是Bp全球群体的早期储存库并向其他地区传播。Bp通过内吞作用主动侵入细胞，在细胞内增殖并可感染几乎任何器官，其微生态稳定性在暴雨、台风等环境扰动下被打破，导致疾病传播。全球每年约16.5万人感染Bp，其中约8.9万人死亡。

中国海南岛地处热带，地理环境封闭，利于Bp生长繁殖，近年类鼻疽病例报告增多。农民因接触污染土壤和水源而感染风险较高。Bp基因组具有高GC含量和大量重复序列，是迄今已知最大、最复杂的细菌基因组之一。尽管美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）存储较多Bp基因组序列，但相关研究多依赖二代测序技术，短读长测序难以提供完整基因组信息且不易区分核基因组与质粒。三代测序技术可更准确完成Bp基因组测序，如PacBio单分子实时测序平台通过从头组装可获得无缺口、无错配的完整Bp基因组序列。

当前Bp菌株分离培养和鉴定仍是诊断金标准，但该方法灵敏度低、耗时长，不利于快速早期诊断。2017年，张锋团队发现CRISPR相关蛋白Cas13a可靶向RNA并通过“旁切活性”非特异性降解报告RNA，在此基础上开发出SHERLOCK检测技术，整合RPA、T7转录、Cas13a检测与荧光信号收集，在多种病原体诊断中展现出巨大潜力。近年来中国和泰国研究团队也报道利用CRISPR-Cas12a技术实现Bp快速检测，但所用CRISPR RNA（crRNA）序列不同，导致检测的Bp群体范围存在差异。因此，本研究基于海南地方性Bp菌株基因组序列分析，设计靶向Bp基因组特异保守基因序列的crRNA，构建SHERLOCK反应体系，建立荧光法与侧流层析试纸条法两种技术平台，验证该方法对海南地方性Bp菌株快速诊断的准确性与可靠性。

MATERIALS AND METHODS

样本收集

本研究共使用53株临床菌株，包括42株Bp、2株洋葱伯克霍尔德菌、2株肺炎克雷伯菌、2株铜绿假单胞菌、1株大肠埃希菌、2株金黄色葡萄球菌和2株肺炎链球菌，所有菌株保存于-80°C。

药敏试验

参照CLSI M45-2016推荐的肉汤微量稀释法进行药敏试验，覆盖复方新诺明（SXT）、头孢他啶（CAZ）和亚胺培南（IPM）三种抗生素。

DNA提取与浓度测定

使用Qiagen Genomic Tip 20/G试剂盒提取核酸，严格按说明书操作。通过Qubit荧光计和Nanodrop分光光度计评估DNA浓度与纯度，提取的DNA保存于-80°C备用。

文库构建与全基因组测序

文库构建与质控

使用Covaris G-tube将DNA随机片段化为15 kb片段，采用PacBio文库制备试剂盒去除单链悬垂并修复DNA损伤。在DNA片段3′和5′末端连接哑铃适配器，用核酸酶降解多余片段，经AMpure PB磁珠纯化后，使用BluePippin仪回收目标片段构建测序文库。通过Qubit荧光计定量文库浓度，Agilent 2100仪评估文库大小与适用性。

全基因组测序

采用PacBio RS II系统进行从头基因测序，随机选择42株Bp中的16株进行全基因组测序。

生物信息学分析

原始数据预处理与基因组组装

使用SMRT Link v.8.0软件处理原始数据，参数设置为minPredictedAccuracy 0.9和minPasses ≥5，生成环形共识序列（circular consensus sequencing, CCS）。过滤连接子和短CCS读长（长度<2 kb）获得清洁CCS读长，经hifiasm软件组装为重叠群（contigs）或支架（scaffolds）。采用Circlator v.1.5.5调整起始位点完成环化，Pilon v.1.22软件基于二代数据校正错误，最终获得高精度全基因组序列。

基因组组分分析

1. 1.

   编码基因预测：使用Prodigal v.2.6.3软件预测编码基因。

2. 2.

   基因组重复序列预测：通过RepeatMasker v.4.0.5识别重复序列。

3. 3.

   非编码RNA预测：采用Infernal v.1.1.3预测核糖体RNA（rRNA），tRNAscan-SE v.2.0预测转移RNA（tRNA）。

4. 4.

   CRISPR预测：利用CRISPRFinder预测CRISPR序列。

5. 5.

   前噬菌体预测：通过PhiSpy v.2.3软件预测前噬菌体区域。

全基因组基因功能注释

1. 1.

   EggNOG数据库注释：使用RPS-Blast工具比对基因蛋白序列与EggNOG数据库，获取注释分类信息。

2. 2.

   毒力因子数据库（Virulence Factor Database, VFDB）注释：将预测基因蛋白序列与VFDB核心数据比对，注释毒力因子。

3. 3.

   综合抗生素耐药数据库（Comprehensive Antibiotic Resistance Database, CARD）注释：通过CARD中的耐药基因标识符（Resistance Gene Identifier, RGI）工具比对，识别抗生素耐药基因。

基因组圈图绘制

使用Circos v.0.66软件可视化基因组圈图。

比较基因组学研究

1. 1.

   基因家族聚类与差异基因分析：采用OrthoMCL软件默认参数分析16株Bp与参考株K96243的同源蛋白编码序列，基于氨基酸序列相似性进行同源聚类，生成遗传同源性矩阵并可视化花瓣图，统计核心基因家族与特异基因家族。

2. 2.

   系统发育分析：通过PhyML软件构建最大似然（maximum-likelihood, ML）树，研究菌株间进化关系。

3. 3.

   基因共线性分析：利用MCScanX软件分析基因共线性，比较参考株与K96243的共线性关系。

RPA体系建立

使用Primer Premier 6.0设计引物，在CRISPR/Cas13a系统crRNA靶向特定RNA序列的基础上，于正向引物5′端添加T7启动子序列（TAATACGACTCACTATAGGG），促进RPA扩增产物从DNA转录为RNA。共设计三对正向引物（F1–F3）和三对反向引物（R1–R3），形成九对不同引物组合。

在相同DNA浓度、扩增温度与时间条件下，测试九对引物的扩增效率，通过凝胶电泳比较并筛选高效引物。按TwistAmp Basic RPA试剂盒说明调整体系，50 μL RPA扩增体系包含Primer Free Rehydration buffer 29.5 μL、无DNase水11.2 μL、正向引物2.4 μL（10 μM）、反向引物2.4 μL（10 μM）、模板DNA（Bp DNA）2 μL和醋酸镁（MgOAC）2 μL（280 mM）。加入MgOAC后充分混匀，短暂离心，39°C孵育20分钟。扩增产物经DNA回收试剂盒纯化后，进行凝胶电泳分析。

SHERLOCK体系建立

crRNA设计

CRISPR/Cas13a系统的crRNA由保守重复区与间隔区组成，本研究选用Bp TTS1-ORF2序列，检测靶点位于RPA扩增片段之间且避免与RPA引物区域重叠。靶序列长28核苷酸，与crRNA间隔区反向互补。

SHERLOCK反应体系配置

SHERLOCK反应体系（20 μL）包含：10.6 μL DEPC处理水、2 μL 10× buffer、0.8 μL核糖核苷三磷酸、0.6 μL T7 RNA聚合酶、1 μL核糖核酸酶抑制剂、1 μL LwaCas13a（1 μM）、1 μL crRNA（1 μM）、1 μL荧光RNA报告分子/侧流层析试纸条RNA报告分子和2 μL RPA产物。全程低温操作。

SHERLOCK荧光检测体系建立

反应混合物转移至定量PCR管，置qPCR仪中37°C反应，每分钟监测荧光强度变化。曲线显著弯曲或达平台期判为阳性；无有效信号、曲线平坦判为阴性。

SHERLOCK侧流免疫层析试纸条体系建立

反应混合物转移至0.2 mL PCR管，PCR仪37°C反应30分钟。反应后加30 μL DEPC水使总体积达50 μL，混匀后检测。将试纸条结合垫端插入PCR管，确保液面不超结合垫顶部，反应1–2分钟使解释区充分浸润。质控线（C线）显色后取出试纸条读数，10分钟内判读结果。T线与C线均显红色条带为阳性；仅C线显红色、T线无色为阴性；T线与C线均无色或仅T线显色、C线无色为无效。

灵敏度、特异性与检测限（Limit of Detection, LOD）分析

以培养法为金标准，评估SHERLOCK检测体系性能。测试42株Bp和11株对照菌株（包括洋葱伯克霍尔德菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌），DEPC水作阴性对照。提取DNA后经RPA进行SHERLOCK荧光与侧流层析试纸条检测，与传统培养技术结果比较。灵敏度计算公式：真阳性/（真阳性+假阴性）×100%；特异性计算公式：真阴性/（真阴性+假阳性）×100%。

将Bp DNA浓度从1 ng/μL倍比稀释至10^?1–10^?7 ng/μL，各稀释度进行RPA，阴性对照模板用DEPC水替代。稀释DNA模板用于SHERLOCK荧光与侧流层析试纸条检测，各浓度重复三次，观察记录荧光曲线变化与检测线。

RESULTS

结构基因组学分析

16株Bp菌株全基因组测序显示，每株菌基因组含两条染色体（Bp-11额外含质粒），总基因组大小7.1–7.3 Mb，染色体1较大、染色体2较小。Prodigal v.2.6.3软件预测每基因组含5,759–6,011个蛋白编码基因。所有菌株均有12个rRNA基因（包括4个5S rRNA、4个16S rRNA和4个23S rRNA），tRNA基因数62–66个。基因组重复序列长度275,435–285,614 bp。所有菌株染色体1均含4个CRISPR序列。前噬菌体数量在染色体1和2间变异，染色体2前噬菌体数量多于染色体1。Bp-11基因组含三个前噬菌体：两个位于质粒，一个位于染色体2。

功能基因组学分析

EggNOG功能注释

Bp-11除两条染色体外还识别出一个质粒。EggNOG功能注释将编码DNA序列（coding DNA sequences, CDSs）分为23组，不同颜色表示。组S（功能未知）无注释代表，其余22组代表不同功能注释。Bp-11两条染色体上4,614个注释基因中，825个基因未注释、功能未知，占全部CDSs的17.48%。功能类别前三位为E组（氨基酸转运与代谢）、R组（一般功能预测）和C组（能量产生与转换）。基因组中无Y组（核结构）或Z组（细胞骨架）注释基因。

功能分类与基因组定位

Bp-11基因组圈图显示：染色体1大小3,929,742 bp；染色体2大小3,105,737 bp；质粒为闭合环状双链DNA结构，大小217,237 bp。与染色体相比，质粒重复序列较少、GC含量较低，且无tRNA与rRNA基因。

VFDB注释

通过VFDB识别毒力因子。为分析毒力基因与临床结局的相关性，根据患者临床结局将16株Bp分为死亡组（5株）与好转组（11株）。VFDB注释共识别17个毒力因子。katA、algU、clbD、clbF、Cj1435c、ybtS、recN、fbpC iron(III)、cdpA、cheA和rcsB等毒力基因在死亡组与好转组中均存在。编码3型菌毛蛋白的mrkD基因仅存在于死亡组。porB、allB、allC、pvdQ和bprA基因仅存在于好转组的Bp-7和Bp-16菌株。

CARD数据库注释

CARD注释前，药敏试验显示16株Bp对SXT、CAZ和IPM均敏感。CARD数据库注释识别出7个抗生素耐药基因：adeF、amrA、amrB、OXA-57、OXA-59、R39和Omp38。这些基因的耐药机制包括：adeF、amrA和amrB涉及抗生素外排泵；OXA-57、OXA-59和R39导致抗生素失活；Omp38降低抗生素渗透性。

比较基因组学分析

基因家族聚类与差异基因分析

16株Bp与参考株K96243的基因家族聚类结果显示，16株菌共享5,192个基因家族。特异基因家族分布：Bp-8有1个特异基因家族（烯酰基载体蛋白还原酶），Bp-11有2个（整合酶核心结构域；转座酶），K96243有8个（免疫球蛋白I-set结构域；解离酶N端结构域；H-NS组蛋白家族；螺旋-转角-螺旋结构域；噬菌体P2 GpE；LysR底物结合结构域；噬菌体整合酶家族；腺苷酰硫酸激酶），其余菌株未发现特异基因家族。

系统发育分析

16株Bp与参考株K96243的基因聚类与系统发育分析构建系统发育树。自举值大于75的分支视为可靠。该系统发育树中Bp-2、Bp-7、Bp-13和Bp-16分支支持值为57，不可靠；其他分支支持值89–100，可靠。尽管16株海南Bp分布于系统发育树不同分支，但最终汇聚于同一根节点，属于同一群。Bp-12与Bp-14亲缘关系最近，其次为Bp-10与Bp-9，Bp-11与K96243亲缘关系最近。

基因组共线性分析

通过连接16株测序菌株与参考株K96243的同源基因分析基因组共线性。共线性图中不同颜色代表不同同源基因对。分析显示16株Bp与参考株K96243存在大量同源基因。

特异性SHERLOCK检测体系的建立与优化

确定Bp靶基因

基于测序结果与文献报道，Bp分泌系统组分TTS1存在于所有Bp菌株且高度保守。此外，TTS1基因簇编码区内的ORF2为Bp特有，在泰国伯克霍尔德菌和洋葱伯克霍尔德菌等近缘种中缺失。因此选择TTS1-ORF2基因组序列（GenBank: AF074878）作为RPA靶片段，合成与靶序列互补的crRNA后建立SHERLOCK检测体系。

RPA引物筛选

基于TTS1-ORF2基因组序列结构特征设计九对引物进行RPA扩增。扩增产物电泳分析显示约200 bp处出现目标条带，400–500 bp处条带归因于T7启动子引起的非特异性扩增。其中F3+R1、F3+R2和F3+R3引物对产生清晰条带且扩增效率良好。ImageJ软件评估条带亮度显示F3+R1、F3+R2和F3+R3引物对亮度最强。综合认为F3+R1、F3+R2和F3+R3引物对对TTS1-ORF2基因的RPA扩增效率最高。为评估其在SHERLOCK荧光检测体系中的性能，测试这三对引物对。相同扩增条件下，F3+R3引物对产生的荧光信号增幅最高，扩增效率最佳，故选择F3+R3引物对用于后续研究。

SHERLOCK检测体系的灵敏度与特异性分析

SHERLOCK荧光法中，所有42株Bp阳性菌株的荧光曲线较对照组均呈现明显上升趋势。最低荧光值约达10,000，多数反应20分钟内形成明显增长信号，判为阳性检测结果。11株对照菌株与DEPC水的曲线无显著上升趋势，与阴性对照相似，检测结果阴性。

SHERLOCK试纸条法中，所有42株Bp阳性菌株均显示清晰检测线，确认阳性结果。11株对照菌株对应试纸条仅质控带可见，无T线出现，结果阴性。

综上，SHERLOCK荧光法与试纸条法结果一致，灵敏度100%。11株对照菌株检测均为阴性，证实SHERLOCK体系特异性高（100%），且与其他菌株无交叉反应。此外，核酸提取（按说明书约20分钟）与RPA扩增（约20分钟）时间共约40分钟。最终SHERLOCK荧光检测（20分钟后读荧光值）总耗时60分钟。SHERLOCK试纸条法需37°C孵育30分钟后检测，总耗时约70分钟。因此两种方法均可在1–2小时内实现Bp快速检测。

SHERLOCK荧光法的检测限分析

为确定SHERLOCK荧光法与侧流免疫层析试纸条法对Bp核酸的检测限（LOD），将Bp菌株10倍梯度稀释至10^?1–10^?7 ng/μL，采用这些稀释样本评估LOD，DEPC水作阴性对照。各浓度重复三次，观察记录荧光曲线变化与检测线（要求检测率100%）。

结果显示，随Bp核酸浓度稀释，实时荧光值逐渐降低，检测灵敏度下降。LOD为10^?4 ng/μL（100 fg）。此外，反应开始20分钟内可检测到荧光值，表明SHERLOCK荧光法可在短时间内快速检测靶核酸。采用SHERLOCK试纸条法检测，最终检测限为10^?3 ng/μL。

DISCUSSION

Bp是类鼻疽病的病原体，该人畜共患传染病急性病例死亡率20%–50%，在诊断设施设备有限的资源匮乏地区死亡率更高，尤其伴严重合并症患者。海南岛相对封闭的地理位置使过去15年Bp菌株遗传谱系稳定，仅出现少数新序列型。克隆群体内大部分遗传信息一致，保证通过岛内菌株宏基因组分析获取基因组数据的可靠性。尚无研究利用三代测序技术对海南Bp菌株进行结构基因组学、功能基因组学与比较基因组学分析。本研究利用PacBio测序平台获取海南地方性Bp菌株高完整性、准确的全基因组序列，完成结构基因组学、功能基因组学与比较基因组学研究。基因组大小7.1–7.3 Mb，GC含量68.06%–68.29%。组装基因组中CDSs总数5,759–6,011。各基因组含4个5S rRNA、4个16S rRNA和4个23S rRNA。tRNA数62–66，基因组重复序列长度275,435–285,614 bp。此外，所有16株菌染色体1均含4个与细菌免疫相关的CRISPR序列。Bp菌株基因组中还识别出多个前噬菌体。先前研究表明前噬菌体结构可能与毒力和抗生素耐药特性相关。不同菌株前噬菌体位置与数量的变异提示毒力与抗生素耐药谱的潜在差异。

与其他数据库相比，VFDB更专注于细菌病原体毒力因子信息的收集与更新，广泛用于生物信息学研究，尤其在毒力因子预测与分析中。本研究通过VFDB在分析菌株中共识别17个毒力因子。其中katA、algU、clbD、clbF、Cj1435c、ybtS、recN、fbpCiron(III)、cdpA、cheA和rcsB基因在死亡组与好转组中均存在。编码3型菌毛蛋白的mrkD基因仅存在于死亡组，提示mrkD基因可能存在导致死亡组毒力较高，考虑其与菌毛蛋白产生相关，对细菌黏附与致病性至关重要。先前研究已识别Bp的其他毒力因子，包括3型分泌系统基因簇、6型分泌系统基因簇、自转运蛋白复合体bimA基因、编码鞭毛蛋白的fliC基因以及与荚膜多糖相关的wcb基因簇。本研究识别的毒力因子与既往研究不同，表明16株海南Bp菌株可能具有独特毒力谱，提示Bp菌株毒力特征存在地区变异，与其他地区菌株相比可能具有不同分布与影响。本研究识别的毒力基因不仅提供对Bp致病机制的见解，也为分子诊断与类鼻疽病疫苗开发提供潜在靶点。

Bp对多种常用抗生素具有天然耐药性，限制临床可用治疗选择。耐药机制包括酶介导失活、靶位点改变与细菌细胞外排。此外，某些特定基因的改变也导致天然耐药，如PenA基因突变或过表达可引起CAZ耐药。amrR基因内特定突变导致amrAB-oprA外排泵转录水平上调，与美罗培南耐药相关。CARD数据库不仅可搜索靶菌株中已识别的耐药基因，其RGI工具还可预测潜在耐药基因。尽管需要用户具备一定专业知识与操作技能，它仍是耐药基因研究最常用工具之一。本研究通过CARD数据库分析16株海南Bp菌株，识别出7个抗生素耐药基因：adeF、amrA、amrB、OXA-57、OXA-59、R39和Omp38。识别出的耐药基因中，adeF、amrA和amrB与抗生素外排泵产生相关。具体而言，AdeF通过主动外排抗生素介导对四环素类与氟喹诺酮类的耐药。AmrA和amrB是Bp多重抗生素外排泵AmrAB-OprA的两个重要组分，与氨基糖苷类抗生素耐药相关。相反，OXA-57和OXA-59是Bp基因组中的常见基因，主要表达D类β-内酰胺酶。但多数研究表明Bp对头孢菌素的耐药主要与A类β-内酰胺酶相关，由耐药基因PenA介导。omp38是Bp基因组中的独特基因，主要编码位于Bp细胞膜上的孔蛋白，但研究表明其与抗生素耐药无关。此外，尚无关于Bp耐药基因R39的相关研究报告。根据功能注释结果推测它可能产生β-内酰胺酶，与青霉素抗生素耐药相关，需进一步分析。16株Bp的药敏试验显示对SXT、CAZ和IPM敏感。这些菌株基因组中缺乏BpeEF-OprC外排泵结构与它们对SXT的100%敏感性一致。

16株Bp与参考株Bp K96243的基因家族分析显示核心基因组由5,192个基因组成。系统发育分析表明所有16株菌亲缘关系密切，共享共同祖先，属于同一群。有趣的是，Bp-1、-3、-4和-5亲缘关系密切，但Bp-1、-3和-4出现在死亡组，而Bp-5仅出现在好转组，表明尽管遗传关系密切，毒力水平可能不同，增加Bp感染后临床表现的复杂性。基因组共线性分析显示16株测序Bp与参考株K96243存在大量同源基因。共线性图显示基因位置与颜色的变异性反映菌株间遗传多样性。这些发现提示海南Bp菌株表现出显著遗传多样性，这种多样性可能归因于选择压力驱动某些菌株适应性进化，导致观察到的基因组变异。

SHERLOCK技术自发明以来已用于检测多种病原体。近年来出现关于类鼻疽诊断的相关报道。但基于CRISPR/Cas系统检测的Bp特异性靶基因序列不同。例如，张等从Bp染色体1和染色体2的核心基因组序列中通过生物信息学识别44个特异性序列标签，选择其中两个用于开发双靶点RPA-CRISPR/Cas12a检测方法，最终实现Bp检测并显示高特异性。在泰国另一项研究中，研究人员通过计算机模拟搜索保守CRISPR-Cas12a靶点，将获得的Bp高度特异性靶序列命名为crBP34，基于该序列开发CRISPR-Cas12a诊断方法，能够检测所有地方性Bp临床菌株，同时区分人类与其他病原体，包括其近缘种泰国伯克霍尔德菌。与上述研究不同，本研究通过靶向Bp中特异保守序列TTS1-ORF2，开发用于Bp菌株快速检测的SHERLOCK体系。该体系整合CRISPR/Cas13a技术与RPA，为该地区类鼻