混合生物膜自然转化实验揭示人源环境葡萄球菌作为SCCmec元件向金黄色葡萄球菌转移的关键载体

本研究通过混合生物膜自然转化实验，首次系统性证实人源和宠物源凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）可高效将SCCmec（葡萄球菌染色体盒mec）转移至甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA），揭示S. epidermidis、S. felis和S. capitis为关键供体物种，为MRSA（甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌）的起源和传播机制提供了直接实验证据。

　　

ABSTRACT

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是引起医疗相关、社区相关和牲畜相关感染的重要病原体。其耐药基因mecA位于可移动遗传元件葡萄球菌染色体盒_mec（SCC_mec）上。该元件在栖息于人类和动物宿主的葡萄球菌间广泛共享，被流行病学确认为SCC_mec的遗传库。然而，多种耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）作为SCC_mec供体向金黄色葡萄球菌转移的能力尚未通过实验验证。本研究采用新型混合生物膜自然转化方案，测试了157株来源于宠物、肉类、牲畜和人类的MRS分离株将SCC_mec转移至甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）的能力。结果发现，25株（16%）菌株能够成功转移SCC_mec，其中表皮葡萄球菌（约33%）、猫葡萄球菌（40%）和头状葡萄球菌（30%）为最有效的供体物种。来自肉类和牲畜的分离株（越南和泰国）转移率较低（分别为5%和3%），而来自日本的人类和宠物分离株转移率较高（分别为35%和25%）。SCC_mec转移依赖于由完整attB位点介导的特异性整合/切除过程，该位点被SCC重组酶Ccr识别。本研究首次实验证明人类生活环境中存在可转移SCC_mec的供体菌，凸显了特定葡萄球菌物种在MRSA进化中的重要性。

INTRODUCTION

葡萄球菌属包含80多个物种，是人类和温血动物皮肤及黏膜表面的常见定植菌，也广泛存在于环境中。其中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌致病性最强，可引起从浅表皮肤脓肿到脑膜炎、肺炎和败血症等危及生命的感染。抗生素耐药性的快速出现已成为全球性威胁，世界卫生组织预测至2050年抗菌素耐药性（AMR）将成为主要死亡原因。MRSA作为ESKAPE病原体中的重要成员，是导致AMR的主要因素，其在住院患者中的流行率存在显著地区差异。MRSA的耐药性由mecA基因（及其同源基因mecB、mecC和mecD）介导，该基因编码低亲和力青霉素结合蛋白PBP2'，位于可移动遗传元件SCC_mec上。SCC_mec在葡萄球菌、哺乳动物球菌和巨球菌属间共享，目前已报道至少15种类型。凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）被认为是SCC_{mec的重要储存库，mecA基因及其他元件的进化前体已在动物共生CoNS中发现。尽管流行性MRSA克隆的扩张在全球传播中起作用，进化模型预测金黄色葡萄球菌至少独立获得SCCmec20次。然而由于缺乏合适的实验系统，不同环境来源的MRS作为SCCmec供体的能力尚未被深入研究。}

RESULTS

自然转化在混合生物膜中可实现SCC_mec从MRSA向MSSA转移

研究团队先前证实了使用活供体细胞在高供受体比例（5,000:1）的混合生物膜中可实现SCC_mec类型I和IVa的转移。本研究中进一步验证了其他类型（IVd、IVh、IVi、IVj、VII、VIII、II.4）的转移能力。所有测试的MRSA菌株均可作为供体，平均转移频率在10^?8至10^?4之间。阴性对照受体菌株NefΔcomE（缺乏编码DNA摄取机制的comE操纵子）未发生转移。通过全基因组测序和SCCmecFinder分析，证实了转化子中SCC_mec元件的完整整合。

可转移SCC_mec至金黄色葡萄球菌的MRS特征

从人类（日本）、宠物（日本）、牲畜（越南）和肉类样本（越南和泰国）中筛选的157株MRS分离株均携带mecA基因和多样化的SCC_mec元件。使用多种MSSA受体菌株进行转化实验，发现25株（16%）能在至少一次独立实验中成功转移SCC_mec。转化频率显示明显的物种依赖性：表皮葡萄球菌中约33%（10/30）可作为供体，猫葡萄球菌为40%（4/10），头状葡萄球菌为30%（3/10）。相反，其他物种如施氏葡萄球菌（1/27）、鸡葡萄球菌（1/16）和溶血葡萄球菌（0/11）转移率较低。地域分析显示，来自宠物和人类的分离株转移率较高（分别为25%和35%），而肉类和牲畜来源的菌株转移率显著较低（分别为5%和3%）。

SCC_mec转移依赖于attB序列

SCC_mec的整合和切除发生在orfX基因的attB位点，由盒染色体重组酶（Ccr）介导。实验表明，使用attB突变受体菌株时，SCC_mec转移频率显著降低（COLw/oφ供体降低约10倍，J-P10供体降低13倍，J-P15供体未检测到转移），证实了attB序列在混合生物膜转化中的关键作用。

DISCUSSION

本研究首次提供了环境中存在可向金黄色葡萄球菌转移SCC_mec供体菌的实验证据。优化后的混合生物膜转化方案将转化效率提升至10^?2水平，突破了传统方法的局限性。研究发现表皮葡萄球菌（主要携带SCC_mec IVa）、猫葡萄球菌和头状葡萄球菌是最有效的供体物种，这与既往研究认为表皮葡萄球菌是SCC_mec IV型储存库的结论一致。值得注意的是，猫源性猫葡萄球菌作为高效供体的发现，支持了伴侣动物在耐药性传播中的作用。尽管进化研究表明SCC_mec起源于施氏葡萄球菌等CoNS物种，但这些菌株在实验中的转移成功率极低，表明SCC_mec向金黄色葡萄球菌的转移可能优先通过其他物种进行。人类-宠物密切互动创造的生态重叠为基因交换提供了有利环境，β-内酰胺类抗生素在兽医领域的广泛使用进一步驱动了耐药性的出现。研究还发现越南等高流行区的肉类分离株转移率高于泰国等低流行区，提示区域抗生素使用和医疗实践对AMR传播的影响。这些发现强调了人类、动物与环境在抗生素耐药基因传播中的复杂联系，支持了采用One Health策略应对全球AMR危机的紧迫性。

MATERIALS AND METHODS

菌株、引物和培养基

实验使用157株MRS分离株和多种金黄色葡萄球菌受体菌株。菌株在TSB培养基中常规培养，转化实验使用CS2合成培养基。抗生素选择使用氯霉素（12.5 μg/mL）、四环素（5 μg/mL）、卡那霉素（100 μg/mL）、头孢西丁（4 μg/mL）、头孢美唑（4 μg/mL）或红霉素（16 μg/mL）。

MRS表征

通过PCR检测mecA基因存在，采用多重PCR进行SCC_mec分型。质谱鉴定使用MALDI Biotyper系统完成。

抗菌药物敏感性试验

根据CLSI标准进行纸片扩散试验，使用oxacillin（1 μg）和cefoxitin（30 μg）药敏纸片。通过生长试验测试菌株对红霉素、四环素、氯霉素和卡那霉素的敏感性。

使用活供体的自然转化试验

将供体与受体按5,000:1比例混合于CS2培养基中，在聚苯乙烯6孔板中静态培养2天（37°C）。24小时后更换培养基，收集生物膜并涂布于含抗生素的BHI琼脂平板筛选转化子。转化频率计算为转化子数与受体总CFU数的比值。

基因组测序与分析

使用溶葡萄球菌素裂解细胞后，通过酚-氯仿法提取DNA。基于MGI DNBSEQ平台进行基因组测序，使用SeqMan NGen进行从头组装，并通过SCCmecFinder和Megalign Pro进行整合分析。

统计学分析

使用GraphPad Prism进行Fisher精确检验或双尾Student t检验，显著性水平设定为P < 0.05, *P < 0.01。