追踪微囊藻病毒多样性及其与宿主互作：揭示伊利湖蓝藻水华动态的新机制

本研究通过宏基因组学分析，揭示了淡水蓝藻水华（cHAB）中微囊藻病毒（Microcystis viruses）的多样性、宿主范围及生态功能。研究发现病毒群落结构与藻类群体形成（colony formation）密切相关，并鉴定出病毒携带的辅助代谢基因（AMGs）可能调控宿主代谢。该研究为理解病毒介导的藻华消长机制提供了新视角。

　　

ABSTRACT

病毒对微生物群落组成和功能具有重要影响，然而它们在淡水蓝藻有害藻华（cyanobacterial harmful algal blooms, cHAB）发展过程中的作用仍知之甚少。本研究通过宏基因组学方法，对伊利西湖盆区季节性微囊藻水华中的病毒进行了分析。基于序列同源性，我们鉴定出与已知分离株高度相似的全球分布微囊藻病毒。利用机器学习模型预测了未表征病毒种群与微囊藻及非微囊藻宿主之间的关联。通过水样粒径分级，我们发现微囊藻病毒多样性存在显著的粒径特异性趋势，这与微囊藻遗传多样性相对应。病毒多样性在非群体相关组分中最高，在群体相关组分中最低，表明群体形成可能导致cHAB中病毒多样性的瓶颈效应。

INTRODUCTION

铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）是一种能够形成群体的蓝藻，在全球淡水和河口系统中形成有毒的cHAB。其产生的微囊藻毒素对人类健康有害，并影响饮用水质量和水生生态系统健康。由于气候变化和富营养化，微囊藻水华的频率和强度不断增加。虽然非生物因素对微囊藻水华发展的作用已得到广泛研究，但生物因素（如捕食关系）的作用仍较少被了解，部分原因是在复杂群落环境中研究微尺度生态互作存在挑战。

作为微生物捕食者，病毒通过感染和裂解宿主对微生物群落施加自上而下的控制。它们还重编程宿主代谢，促进基因转移，并通过病毒编码的辅助代谢基因（auxiliary metabolic genes, AMGs）影响宿主适应性和生态系统级营养循环。先前对分离微囊藻病毒的研究为了解病毒-微囊藻互作提供了基础见解，但对微囊藻病毒时空变异的理解仍有限。

RESULTS

Tracking Microcystis hosts in the 2014 Lake Erie seasonal cHAB

Microcystis populations showed the greatest abundance and lowest overall evenness in colony fraction

2014年夏季至秋季，在伊利西湖盆区三个站点进行了水样采集。颗粒藻蓝蛋白（作为蓝藻指标）和微囊藻毒素（指示水华毒性）浓度显示8月初所有采样点均出现了有毒微囊藻水华。9月末的水华主要出现在近岸站点，微囊藻毒素浓度低于8月4日。

通过滤膜粒径分级分离了自由生活和群体形式的微囊藻及其病毒。从这些数据中重建了50个细菌宏基因组组装基因组（metagenome-assembled genomes, MAGs），其中26个被分类为微囊藻。在两个水华高峰期（8月4日和9月29日），微囊藻MAGs的相对丰度在100微米组分中最高，该组分中也观察到最低的均匀度，表明少数优势phylotypes的克隆扩张。

Genetic variation of Microcystis populations corresponded with size fraction

在水华高峰期，基于全基因组核苷酸一致性和基因聚类分析，观察到微囊藻种群存在明显的粒径特异性遗传分化。100微米滤膜上的微囊藻MAGs基于平均核苷酸一致性（average nucleotide identity, ANI）聚类在一起，被分类为四个不同的种或株系类型。较小粒径组分中的微囊藻MAGs主要由铜绿微囊藻C型主导。当考虑微囊藻MAG泛基因组辅助基因簇时，33.3%的变异可由滤膜组分解释，100微米MAGs沿主成分1形成明显分组。

Identification of Microcystis viruses in the 2014 Lake Erie bloom

Globally distributed Microcystis viruses identified through sequence homology

从总contig池中鉴定出27,086条长度大于3kb的病毒contig，将其分箱并聚类为15,461个非冗余病毒操作分类单元（viral operational taxonomic units, vOTUs）。我们鉴定了4个推定的微囊藻vOTUs与4个已知微囊藻病毒分离株高度相似。其中vOTU_4的代表病毒被重命名为Ma-LEF01，与先前从2019年伊利湖cHAB宏基因组组装的病毒contig MVGF-J19具有高度相似性（>99% ANI）。Ma-LEF01携带一个编码藻胆体降解蛋白的nblA基因同源物。

Uncharacterized viral OTUs predicted to infect Microcystis

使用病毒-宿主互作预测器（virus-host interaction predictor, VHIP）预测了未培养和未表征病毒与微囊藻MAGs之间的可能感染联系。在8月4日毒性水华高峰期，预测了2,026对病毒-宿主关联，涉及454个vOTUs和17个细菌MAGs（其中9个为微囊藻MAGs）。在9月29日非毒性水华高峰期，预测了1,995对病毒-宿主关联，涉及339个vOTUs和24个细菌MAGs（其中8个为微囊藻MAGs）。共鉴定出793个推定的微囊藻vOTUs，这些vOTUs长度范围为10,015-399,821bp，平均38,916bp，约为NCBI中报道的噬菌体平均基因组长度（68.4kb）的一半。

Diversity of predicted Microcystis vOTUs corresponded with colony formation

Microcystis virus alpha diversity was lowest in colony-associated fractions and highest in non-colony fractions

使用序列读段招募估计的vOTU丰度评估了预测感染微囊藻的vOTUs的α和β多样性趋势。香农均匀度在"非群体相关"（病毒、3微米和>0.22微米组分）中最高，在"群体相关"组分（53和100微米）中最低，其中100微米组分的均匀度最低。这些差异在100微米组分与>0.22微米和3微米组分之间具有统计学显著性。

Shifts in predicted Microcystis virus assemblages correlated with sampling fraction and date

微囊藻vOTU组合的β多样性与滤膜组分显著相关，与采样日期也有一定相关性，但与采样站点无关。非度量多维标度（non-metric multidimensional scaling, NMDS）排序显示，微囊藻vOTU组合基于群体相关与自由生活粒径组分分区。在所有测试的环境变量中，只有光合有效辐射（photosynthetically active radiation, PAR）与微囊藻vOTU组合的变异显著相关。

High turnover of abundant putative Microcystis virus populations

为理解2014年伊利湖cHAB中潜在重要推定的微囊藻vOTUs的季节波动和宿主范围，我们鉴定了所有样品中最丰富的10个推定的微囊藻vOTUs。值得注意的是，Ma-LEF01不在这个组中，表明其在采样组分和水华事件中的相对低丰度。细胞组分中的丰富vOTUs在病毒组分中从未丰富。在8月4日和9月29日水华事件期间，丰富vOTUs的最高相对丰度通常出现在群体相关或非相关组分中，只有3个vOTUs在两个日期都高度丰富。

Insights on host range and gene flow through Microcystis virus-host interaction networks

Most predicted Microcystis vOTUs had within-genus host ranges, some spanned phyla

为评估微囊藻vOTU宿主范围及其病毒介导的宿主间基因转移潜力，我们鉴定了也被预测感染非微囊藻MAGs的推定的微囊藻vOTUs。虽然大多数共享病毒在微囊藻MAGs之间共享，但在8月4日和9月29日分别有8个和16个非微囊藻宿主被预测与微囊藻共享病毒。

使用Morimoto等人的分类标准，我们将推定的微囊藻vOTUs的预测宿主范围分类为"窄"（感染1-2个宿主）和"宽"（感染3个或更多宿主）。仅关注微囊藻宿主时，我们发现50%的vOTUs被预测在水华高峰期感染单个宿主，80%被预测感染一个或两个微囊藻MAGs。相比之下，当考虑所有潜在宿主时，67%的vOTUs被预测感染至少三个宿主。我们没有发现vOTU宿主范围宽度与丰度之间的显著相关性。

Microcystis vOTU metabolic genes can be bloom peak-specific

我们鉴定了推定的微囊藻病毒携带的代谢基因，以评估水华期间病毒介导的细菌种群间基因流动的潜力。大多数微囊藻vOTU基因编码功能未知的蛋白质。在可注释的AMGs中，一些在水华高峰期共享，一些独特于8月4日或9月29日的高峰期。

两个水华高峰期都存在的病毒编码AMGs包括GDP-甘露糖4,6脱水酶（用于细胞壁/群体形成中的复杂碳水化合物生物合成、细胞通讯和生物膜形成）、2OG-Fe(II)加氧酶超家族（参与藻胆蛋白和次级代谢产物生产）和钙调神经磷酸酶样磷酸酯酶超家族（磷酸盐代谢调控）。8月4日富集的病毒编码基因包括光合反应中心蛋白（感染期间光合作用的核心）、谷氨酰胺合成酶和NAD依赖性差向异构酶/脱水酶（可能调节宿主氮、氨基酸和能量代谢）以及S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（可能参与感染期间对营养、光和温度变化的细胞响应）。9月29日最丰富的富集病毒编码基因是肽基-tRNA水解酶PTH2（宿主蛋白质合成调控）。过氧化物酶基因ahpC（参与感染期间对氧化应激的细胞响应）也很丰富。

Evaluation of viral morphology diagnostic genes

为评估先前关于特定病毒家族在微囊藻cHAB进展和消亡中作用的报告，我们检查了两个水华高峰期病毒诊断基因的分布，以表征肌病毒、短尾病毒和长尾病毒代表性的变化。一些肌病毒诊断基因（T4样终止酶大亚基、gp20噬菌体T4样门户蛋白）在两个日期相对丰富。然而，其他肌病毒诊断基因（T4加载基因gp59、T4样病毒尾管蛋白gp19）在8月4日明显更丰富。类似地，长尾病毒诊断基因（λ尾组装蛋白、λ噬菌体尾测距蛋白、λ家族噬菌体门户蛋白）在8月4日水华高峰期显示较高的相对丰度。相比之下，短尾病毒诊断基因（T7衣壳组装蛋白、T7尾纤维蛋白、polA T7 DNA聚合酶和HK97推定尾蛋白gp10）在9月29日水华高峰期富集。

DISCUSSION

Fraction-specific Microcystis variation corresponds with virus-host associations and viral diversity through the bloom

这项伊利湖cHAB研究揭示了微囊藻MAGs的组分特异性种群结构。100微米组分中微囊藻MAG丰度的低均匀度表明少数优势phylotypes的克隆扩张，它们可能在