瘤胃微生物代谢能力驱动牛甲烷排放的关键机制与减排策略研究

本研究通过应用分级联合物种分布模型（HMSC）结合宏基因组组装基因组（MAGs）分析，揭示了高/低甲烷排放牛（HEC/LEC）瘤胃微生物组的显著差异：LEC中富集220个MAGs，具有更高代谢能力（MCI）和更低功能冗余性，其微生物群落擅长纤维水解和琥珀酸生产，可能通过替代氢汇途径降低甲烷生成；HEC中191个MAGs显著富集，表现为更高功能冗余和乳酸代谢倾向。该研究为靶向微生物干预以减少畜牧业温室气体排放提供了基因组学依据。

　　

ABSTRACT

瘤胃微生物组在决定牛的饲料转化率和甲烷排放方面起着关键作用，对农业生产力和环境可持续性具有重大意义。本研究采用分层联合物种分布模型（Hierarchical Modeling of Species Communities, HMSC）预测生物因子与通过宏基因组组装基因组（metagenome-assembled genomes, MAGs）确定的微生物种群丰度之间的定向关联。分析揭示了明显的微生物差异：191个MAGs在高甲烷产量（高于24克/千克干物质摄入量[DMI]；高排放牛，HEC）动物中显著更丰富，而220个MAGs在低排放牛（LEC）中更丰富。有趣的是，低甲烷排放瘤胃的微生物群落表现出更高的代谢能力，但功能冗余性较低。研究结果还表明，与低甲烷产量相关的微生物组在特定功能（如活性纤维水解和琥珀酸生产）中较为普遍，这可能增强其对宿主动物饲料转化的贡献。本研究提供了一种以基因组为中心的新方法，用于研究瘤胃的微生物生态，并确定旨在减少 livestock production systems 温室气体排放的微生物和代谢干预靶点。

IMPORTANCE

反刍家畜是全球甲烷排放的主要贡献者，这主要是通过瘤胃中的微生物发酵实现的。理解微生物群落在高甲烷和低甲烷排放动物之间的差异对于确定减排策略至关重要。本研究利用以基因组为中心的方法，将微生物代谢特征与牛的甲烷输出联系起来。通过重建和功能表征数百个微生物基因组，我们观察到低甲烷排放瘤胃拥有平衡、“精简”的微生物群落，其特征是高代谢能力和种群间最小的代谢重叠（低功能冗余）。我们的结果证明了基因组水平功能分析在揭示与气候相关表型相关的微生物群落特征方面的效用。

OBSERVATIONS

反刍动物拥有一个专门的肠道微生物组，由细菌、真菌、原生动物、病毒和古菌组成，这些微生物将纤维饲料发酵成产能的短链脂肪酸，但同时也会产生甲烷（CH₄），一种主要的温室气体。瘤胃微生物可以大致分为利用多种底物的通用型微生物，或占据特定代谢生态位的 specialist，例如产甲烷菌。通用型和 specialist 之间的平衡被认为影响瘤胃微生物组的可塑性（例如灵活性）和代谢效率，最终影响如甲烷排放等表型。具有更高多样性和功能冗余的古菌和细菌微生物组往往更稳定但可塑性较差，而较低多样性的系统则更适应环境变化。特别是在奶牛中，通过基因内容和基于16S-rRNA的结构分析估计的较低微生物组丰富度，与更高的饲料效率和较低的甲烷潜力紧密相关。在此，我们试图探索通过功能表征的微生物基因组评估的微生物组可塑性，如何在具有不同甲烷排放（以克/千克干物质摄入量[DMI]测量）的牛中变化。

为了探索微生物群落响应，我们将HMSC模型拟合到数据中，将MAG丰度与实验变量关联。该分析基于从27个瘤胃样本重建的700个高质量MAGs，这些样本在五个时间点从三头HEC和三头LEC收集，分类基于24克CH₄/千克DMI的阈值。我们以基因组为中心的方法利用 strain-level 功能表征，使我们能够量化来自 pathway annotations 的代谢能力指数（metabolic capacity indices, MCIs），而不是仅仅依赖分类学和基于基因的摘要。模型实现了良好的收敛性（potential scale reduction factor ~1）和跨参数的有效样本量（ESS > 200），支持对MAG丰度的生态驱动因素进行稳健推断。模型中纳入的系统发育聚类揭示了两个进化枝：以 Bacteroidota 为主的进化枝1在LEC中更丰富，而涵盖多个门的进化枝2在HEC中更丰富。一个强烈的系统发育信号，固有于模型，将甲烷产量与MAG丰度联系起来，进化枝1的MAGs在LEC中占主导地位，进化枝2的MAGs在HEC中普遍存在。这识别出191个与HEC显著相关（≥90%后验概率）的MAGs（即在HEC中丰度更高）和220个与LEC相关的MAGs。在模型解释的MAG丰度方差（26.2%）中，13.6%由甲烷产量解释。

METABOLIC EFFICIENCY AND MICROBIAL COMPOSITION VARY ACROSS HIGH AND LOW EMITTING CATTLE

LEC的瘤胃微生物组富含与 Bacteroidota 和 Actinobacteria 相关的种群，这些种群 collectively encode lower functional redundancy。为了进一步探索这一点，我们使用HMSC将基因组推断的功能特征与甲烷产量关联起来。LEC的瘤胃微生物组被预测编码更高的代谢能力，用于降解牛常摄入的淀粉和植物纤维，包括纤维素、木葡聚糖、α-半乳聚糖和木聚糖。此外，还观察到更高丰度的 proficient rumen fibrolytic microbes（例如 Fibrobacter succinogenes, MCI 0.27），以及特定的协同伙伴如 Prevotella ruminicola (MCI 0.27)，这些先前已通过共培养被识别为能增强纤维水解和琥珀酸生产。同时，我们预测LEC-MAGs具有更高的生产琥珀酸的能力。我们还观察到LEC中乳酸代谢和丙烯酸途径的关键酶结构域（EC 2.8.3.1, EC 1.3.8.7, EC 4.2.1.54）少于HEC，同时可检测的乳酸积累也更少，这表明本研究中的LEC群落较少依赖乳酸代谢和基于丙烯酸的丙酸生产。

HEC的瘤胃微生物组特征是具有更高的 Bacillota 与 Bacteroidota 比率以及 Methanobacteriota 丰度的增加，同时微生物群落表现出更高的功能冗余，根据先验知识，这表明较低的代谢效率。通常，更高的功能冗余表明通过允许多个微生物物种执行重叠角色而具有更大的代谢稳定性，但代谢 versatility 较低。鉴于积累的证据已将低甲烷排放动物与增加的乳酸代谢联系起来，我们惊讶地观察到HEC-MAGs生产乳酸的能力增加，以及L-乳酸脱氢酶（EC 1.1.1.27）的拷贝数增加。支持这一点的是，我们还注意到HEC中几个 renowned lactate producers 的MAG丰度增加： Streptococcus spp. (MCI 0.14), Bifidobacterium ruminantium, Kandleria vitulina, 和 Sharpea azabuensis (MCI ≥ 0.22)，共享相同的代谢角色。然而，我们没有检测到公认的将乳酸转化为丁酸和/或丙酸的关键代谢或种群（例如 Megasphaera 和 Coprococcus spp.）。乳酸利用者的缺失也与代谢组学分析中观察到的较高乳酸积累一致，并表明本研究中HEC存在发酵限制。

总的来说，我们的结果强调，低甲烷排放瘤胃拥有以高代谢能力（与HEC相比MCI高20.3%）和种群间最小代谢重叠（低功能冗余）为特征的微生物群落。在此背景下，我们推测一个平衡的、高容量但“精简”的微生物组反映了核心代谢途径，这些途径高度适应本研究中使用的混合草料和浓缩饲料中发现的资源变异性。在LEC中， distinct metabolic strategies 在利用复杂植物多糖和琥珀酸-to-丙酸代谢中 evident，这经常在低甲烷排放微生物组中观察到。相反，本研究中的HEC表现出更高的丙烯酸-CoA和乳酸水平。预测执行乳酸驱动氢 sequestration 至丙酸和/或丁酸的HEC microbiota 的稀缺性表明存在发酵效率低下，这会减少对氢的竞争并可能增加其可用于产甲烷菌的 availability。

我们深受鼓舞的是，我们在此进行的以基因组为中心的分析在很大程度上 mirror 了先前的基于基因和分类学的研究，这些研究将减少的基因和分类学丰富度与高饲料效率和低甲烷生产联系起来。此外，更深层次的基因组功能特征推断重申了多项研究的结果，这些研究表明通过琥珀酸-to-丙酸的瘤胃发酵在LEC微生物组中 prominent。我们承认本研究中使用的有限样本量限制了更广泛的生物学解释；然而，这种方法高度 amenable to scale，并且随着瘤胃微生物组领域继续向以基因组为中心的方法论转变，它将 increasingly applicable。