多糖降解古菌主导酸性热泉：从基因组和培养视角解析 Thermoproteota 门的新谱系

本研究首次成功分离并鉴定了深部分支古菌谱系（原Ca. Marsarchaeota）的纯培养菌株，通过系统基因组学分析将其归类为Thermoproteota门下的新目Tardisphaerales。该研究揭示了其在酸性热泉（pH<5，温度<70°C）微生物群落中高达40%的占比，阐明其通过糖酵解（EMP）、Entner-Doudoroff（ED）和磷酸戊糖途径（PPP）高效降解多糖的独特发酵代谢机制，并解析了其耐酸（K+内流维持膜电位）和抗氧化（Fe-SOD、Rubrerythrin等）的分子基础，为极端环境碳循环和高温酸性糖苷酶（CAZymes）的生物技术应用提供了关键见解。

　　

摘要

测序技术和生物信息学的扩展极大地增进了我们对微生物“暗物质”的理解，然而纯培养的获取——尤其是在古菌领域——仍然罕见且充满挑战。培养对于可靠表征微生物代谢至关重要，这是宏基因组学和其他组学方法无法完全替代的。本研究报道了先前被称为Candidatus Marsarchaeota的深部分支古菌谱系的首个培养代表。我们的系统基因组分析将这些分离株置于Thermoproteota门中，作为一个新目——Tardisphaerales。Tardisphaerales的成员在低于70°C的酸性热泉中主导原核生物群落，占总微生物种群的40%，突显了其生态重要性。功能基因组学和培养实验揭示了一种嗜热酸、厌氧的生活方式，其能量代谢基于碳水化合物发酵，特别是多糖。这种代谢能力得到了大量糖苷酶编码基因的支持，并且在嗜热酸菌中具有前所未有的代谢多功能性。分离株拥有完整的糖酵解（EMP）、Entner-Doudoroff（ED）和磷酸戊糖（PPP）途径，使其能够利用不同的糖类。在多糖水解方面的特化可能为这些生长缓慢的古菌提供了适应性优势，因为大多数其他异养嗜热酸菌更偏好肽或简单糖。此外，针对活性氧（ROS）的强大防御机制和在酸性条件下的持久存活力使Tardisphaerales能够胜过其他异养生物，并在这些极端生境中保持优势。这一新目的发现和培养扩展了原核生物分类学，并揭示了酸性地热生态系统中碳循环的关键参与者。

重要性

自然环境中大多数优势原核生物仍未培养，它们的代谢潜力和生态作用只能从宏基因组学中推断。然而，培养对于全面的功能表征和新性状的鉴定至关重要。在此，我们描述了Thermoproteota门新纲Tardisphaeria（暂定）中新古菌目Tardisphaerales的首个培养代表，该谱系在酸性热泉中含量丰富。通过全基因组重建和纯培养微生物学实验，我们证明这些古菌在代谢上不同于已知的嗜热酸菌，使其成为炎热、酸性环境中复杂有机物的关键降解者。它们的基因组编码了多样化的糖苷酶，允许在高温和低pH下高效分解多糖，这一特性具有广阔的生物技术应用前景。

引言

酸性热泉、周边土壤以及与火山溢流或破火山口密切相关的硫质喷气孔栖息着特定的嗜热酸原核生物，它们适应在低pH值（<5）和高温（≥45°C）下生活。此类环境的微生物群落由生活在热水中的化能无机自养物种和主要定居在沉积物中的异养物种组成。后者以古菌为主，既有培养类群的代表，如Thermoplasma、Sulfolobus、Saccharolobus、Caldisphaera、Acidilobus和Conexivisphaera，也有尚未探索的深部分支谱系。

嗜热酸古菌能够主导这些极端条件得益于一系列适应性特征：通过K⁺内流形成的反向膜电位、初级和次级转运蛋白的作用维持pH稳态，拥有高度不通透的四醚膜，具备针对重金属和酸性条件下大量产生的活性氧（ROS）的防御机制。重要的是，所有分离的嗜热酸原核生物都使用高效的产能机制，基于三羧酸（TCA）循环和呼吸链，因为在多极端条件下生活能量消耗巨大。

大多数已知的异养嗜热酸菌代谢蛋白质类底物和/或简单糖。已研究的嗜热酸古菌拥有糖酵解（EMP）和/或Entner-Doudoroff（ED）途径的修饰变体来分解代谢糖类。古菌细胞中的戊糖降解与细菌显著不同。在Sulfolobus和Saccharolobus（以及一些盐古菌）中，C₅-糖的降解通过转化为2-酮戊二酸进行，并且只有Halorhabdus物种通过非氧化性磷酸戊糖途径（PPP）利用戊糖。

在地热生境中，有机物分解主要始于多糖（PSs）的降解，这些多糖来源于原核生物胞外聚合物、细胞壁成分以及外部有机物，如来自周边区域的高等植物、真菌、地衣和其他物质的残留物。然而，关于嗜热酸原核生物在PSs上生长的数据有限。迄今为止，只有一些来自超嗜热属的嗜酸古菌，如Acidilobus、Caldisphaera和Saccharolobus，已知能利用有限范围的多糖，包括木聚糖、淀粉、糖原、地衣多糖和昆布多糖（后两种仅在Acidilobus中证实）。同时，宏基因组学揭示了地热环境中未培养古菌谱系中编码碳水化合物活性酶（CAZymes）的基因具有最大的多样性和丰度，即Candidatus Brockarchaeota、Ca. Geoarchaeota和Ca. Marsarchaeota。后者在酸性热泉微生物垫、沉积物和热土壤中检测到高丰度，并且基于各种组学分析，推测该群体由嗜热、兼性需氧的化能异养菌组成，可能在低O₂条件下利用Fe³⁺作为末端电子受体。迄今为止，尚未有Ca. Marsarchaeota的代表被纯培养分离，因此它们的特性仍停留在假设阶段。

在这项工作中，我们研究了Ca. Marsarchaeota类群首个培养代表菌株MP-3918和AK-3817的表型特征，并进行了详细的基因组分析。我们揭示了它们的代谢与先前预测的以及迄今为止所有已知的嗜热酸原核生物均有显著不同。这些新古菌仅通过碳水化合物（尤其是多糖）的发酵来保存能量。基因组分析使我们能够厘清其分类学地位，并对新目Tardisphaerales进行比较分析，该目在酸性热泉微生物群落中占有重要部分。

结果

富集与分离

培养物MP-3918在添加淀粉和硫的厌氧培养基中于pH 4.2和54°C下培养100天富集得到。目标类群在获得的初级富集群落中占80%。目标类群仅在第二次传代45天后出现，并持续增加至113天时达到99%。菌株MP-3918仅在改变多糖底物（淀粉、刺梧桐胶、果胶或支链淀粉）后才获得，并在支链淀粉上经过两次额外的连续传代（每次持续100天）后分离出纯培养物。菌株AK-3817是在含有葡萄糖作为唯一碳源和能量来源、补充硫的厌氧培养基（pH 4.0）上于65°C通过一系列后续传代（每次传代培养至少1个月）富集的。为抑制细菌污染物，添加了万古霉素（40 mg L^?1）。此外，将培养物在无硫培养基中加入葡萄糖（或支链淀粉，或淀粉）于70°C下长期培养（1-2个月），并加入新生霉素（40 mg L^?1）以抑制古菌卫星（如Thermoplasma spp.）。菌株AK-3817的纯培养物是通过在含支链淀粉的培养基上于pH 4.0和70°C下使用系列稀释至 extinction 的方法获得的。

表型特征与代谢

菌株MP-3918和AK-3817的细胞为不规则小球菌，直径0.4–1.0 μm，被一层厚的S层（约20 nm）包围，该S层呈规则的p4对称晶格排列。观察到单个菌毛状表面附属物，直径10–12 nm。在电子显微镜下，细胞常看起来瘪塌，增加了表面积与体积的比率。观察到类似于 encapsulin 覆盖的纳米区室的细胞内区室（直径35–40 nm）。两种菌株的主要完整极性脂质是一系列二植烷基甘油二醚（archaeols）和一系列跨膜甘油二烷基甘油四醚（GDGTs），具有0-4个环戊烷部分。在任一菌株中均未检测到古菌醌，可能低于分析检测限。

两种菌株都是嗜热酸菌，最适生长温度为55°C–65°C，最适pH为3.9–4.0，是厌氧化能有机异养菌，能够发酵碳水化合物，尤其是多糖。未观察到自养、无机营养生长（以H₂/硫/Fe²⁺作为电子供体）或呼吸作用（以O₂/硫化合物/Fe³⁺/NO₃^-/NO₂^-作为电子受体）。硫刺激了两种菌株的细胞产量，但即使没有硫也观察到生长。生长曲线显示指数期代时（t_d）为52–91小时。最大细胞产量约为0.8–3 × 10⁸ cells mL^?1，菌株在分批培养中保持高细胞密度达1.5个月。碳水化合物上的主要生长产物是乙酸和CO₂，也检测到痕量的乙醇和正丁酸，且不产H₂。在含硫培养情况下观察到痕量的H₂S。在含氧气氛下培养52天期间，未观察到培养物MP-3918的细胞裂解。当转移到新鲜的厌氧培养基中时，细胞恢复生长并达到预期密度。

基因组特征与系统发育分析

菌株MP-3918的基因组组装成一条大小为1,429,880 bp、G + C含量为53.6%的环状染色体，而菌株AK-3817的基因组由12个scaffold组成，大小为1,498,369 bp，G + C含量为51.9%。后者几乎完整且质量同样高，理论完整度为91.36%（MP-3918完整基因组为92.13%），污染水平为0.93%（两个基因组均如此）。根据NCBI原核基因组注释流程（PGAP），菌株MP-3918/AK-3817的基因组分别包含1,361/1,382个蛋白质编码基因、一个rRNA操纵子、46个tRNA基因、2个ncRNA基因和24/29个假基因。

16S rRNA基因的BLAST分析显示，最接近的亲缘关系是来自日本、台湾和俄罗斯热泉的环境古菌克隆，序列同一性为99.5%–99.9%。相比之下，最接近的培养物种属于Thermoprotei纲，同一性<85%，表明分离株代表了一个新的深部分支谱系。为了确定菌株的确切系统发育位置，基于“ar53”标记集进行了系统基因组分析。该分析显示菌株落在Thermoproteota门内的一个进化枝中。除了我们的菌株，该进化枝还包含先前描述的Ca. Marsarchaeota代表。然而，根据我们的系统发育分析，该组形成了一个目级谱系（提议名称o__Tardisphaerales），它与o__Gearchaeales一起在Thermoproteota门内形成了一个单独的纲。另外两个相对接近的纲是c__Methanomethylicia（应命名为Ca. Methanomethylicia）和c__Thermoprotei；后者包含具有培养物种的目o__Sulfolobales、o__Thermoproteales、o__Thermofilales以及几个没有培养成员的小目。这一分类得到了树拓扑结构和相对进化分歧（RED）的支持。提议的新纲c__Tardisphaeria、c__Methanomethylicia和c__Thermoprotei的RED值分别为0.32、0.337和0.329。这些值相对接近于根据我们的树计算出的纲级别RED中位数——0.391。另一种方案是将图中显示的所有进化枝合并为一个大的纲。然而，该节点的RED值为0.273，显著低于中位数。因此，这种替代分类似乎不正确。

新目应分为两个科：f__Tardisphaeraceae（包括我们的分离株）和f__Martarchaeaceae（包含Jay及其同事先前分析过的宏基因组组装基因组（MAGs））。f__Tardisphaeraceae的RED值为0.857，而f__Martarchaeaceae的为0.756。尽管RED值略高于科级别的中位数（0.72），我们提议这种科级分类是最优的，因为更深节点的RED值为0.436。基于平均氨基酸同一性（AAI）值的比较（考虑属和种的阈值分别为65%和95%），预测f__Tardisphaeraceae内有两个属。其中之一，提议名称为Tardisphaera，分为五个种，包括由菌株MP-3918（Tardisphaera miroshnichenkoaea）和AK-3817（Tardisphaera saccharovorans）代表的两个种。第二科f__Martarchaeaceae包括五个属（每个属有1-4个种）。

基因组分析

分离株的基因组特征反映了其嗜酸生活方式。两个基因组都编码一个K⁺摄取系统，即电压门控通道Kch，推测可提供内部正膜电位。而未发现其他钾转运蛋白Trk、Kdp、Kup以及K⁺/H⁺逆向转运蛋白的基因。质子外流可能通过焦磷酸激酶泵HppA和Cl^?/H⁺逆向转运蛋白ClcA的作用发生。检测到编码无机磷酸盐ABC转运蛋白PstSCAB和参与胞质质子缓冲的协同转运蛋白Pht的基因。未发现提供缓冲能力的脲酶基因，以及催化质子消耗的谷氨酸或精氨酸脱羧酶基因。编码在侵袭性酸性条件下负责DNA修复和正确蛋白质折叠的核酸酶XPF和分子伴侣的基因存在于分离株的基因组中。

从基因组分析推导的代谢特征与生理表征一致。Tardisphaera基因组不拥有CO₂固定途径关键酶的基因。同时，它们获得了大量编码碳水化合物活性酶（CAZymes）的基因：MP-3918和AK-3817的基因组分别编码38和44个糖苷水解酶（GHs）和碳水化合物酯酶（CEs）。糖基转移酶的多样性和功能不是本研究的重点，因此被排除在分析之外。应注意，所有预测的CAZymes活性都是推定的，因为它们仅基于基因组分析。两种菌株都能在糊精、淀粉和支链淀粉上生长，这得益于α-淀粉酶（GH57）、新支链淀粉酶（GH13）、葡糖淀粉酶（GH15）和α-葡萄糖苷酶（GH122和/或GH31）的作用。黄原胶分解途径包括潜在的α-甘露糖苷酶（GH38）、β-葡萄糖醛酸苷酶（GH2）、β-甘露糖苷酶（GH2，仅在AK-3817菌株中发现）、一些内切葡聚糖酶（GH5或GH12家族）以及来自GH116和/或GH3的β-葡萄糖苷酶。两种菌株都能利用β-葡聚糖和昆布多糖，这得益于β-葡萄糖苷酶和来自GH50的内切-β-1,3-葡聚糖酶的作用。木聚糖可以被GH3家族的β-木糖苷酶部分水解，但未发现内切-β-1,4-木聚糖酶基因。研究的菌株观察到在甘露聚糖和半乳甘露聚糖上生长；来自GH5的内切-β-甘露糖苷酶和α-半乳糖苷酶（GH4或GH36家族）参与甘露聚糖降解；然而，β-甘露糖苷酶仅在AK-3817基因组中编码。预测为胞外酶的GHs具有较低的中等等电点（pI）5.15，接近已知表征的嗜酸糖苷酶的pI值。此外，新分离株的胞内糖苷酶甚至显示出小于6的pI值。寡糖或单糖可能通过ABC转运蛋白和不同的porter蛋白导入细胞，而磷酸转移酶系统（PTS）未在基因组中编码。在Tardisphaera基因组中发现了EMP和半磷酸化ED（spED）途径的所有基因。两种菌株都拥有用于半乳糖利用的Leloir途径。木糖可以转化为木酮糖-5-磷酸，随后在非氧化性PPP（noxPPP）中代谢。

基因组分析未揭示编码完整电子传递链（ETC）蛋白的基因，这些蛋白是需氧或厌氧呼吸所必需的。两种基因组中都缺少参与铁还原的多血红素细胞色素编码基因，以及复合铁硫钼蛋白家族氧化还原酶和细胞色素氧化酶的基因，后者分别参与厌氧和需氧呼吸。然而，检测到编码末端醌氧化酶CydAA的基因，尽管其预测的主要功能与质子动势生成无关。TCA循环是不完整的。乙酸可能由乙酰辅酶A在双亚基ADP依赖性乙酸–CoA连接酶的作用下形成。两个双功能丙酮酸氧化还原酶复合物推测负责乙醛的形成，因为基因组中未发现乙醛脱氢酶或丙酮酸脱羧酶的基因。一些众多的醇脱氢酶可能在发酵过程中将乙醛还原为乙醇。尽管发酵产物中存在丁酸，但基因组中未编码已知丁酸形成途径的酶。在两个基因组中都检测到一个编码CoA依赖性NAD(P)H硫氧化还原酶（NSR）的基因。此外，硫的存在刺激了菌株的生长，表明可能存在“facilitated”发酵，导致培养基中H₂S积累。基因组分析未发现编码[NiFe]、[FeFe]或[Fe]氢化酶的基因，这与发酵过程中未观察到H₂产生一致。

基因组分析揭示两个分离株的基因组中都存在编码铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD）、硫氧还蛋白（Trx）、硫氧还蛋白还原酶（TR）和几种过氧化物氧还蛋白（Prx）的基因。此外，我们发现几个可能编码红素氧还蛋白（Rub）的基因，它们通过其结构域组织彼此区分。另外，在两个基因组中都鉴定出肽蛋氨酸亚砜还原酶A（MsrA）和游离蛋氨酸-R-亚砜还原酶（fRmsr）的基因。此外，细胞对氧的保护可能通过CydAA膜复合物还原氧气来实现，其电子供体未知（因为已知醌未被检测到）。虽然鉴定出编码铁蛋白样蛋白的基因，但基因组分析未检测到任何 encapsulin 外壳蛋白，表明观察到的纳米区室在结构上不同于典型的 encapsulins。

我们的分析表明，至少四分之一的涉及所分析代谢系统的基因可能起源于细菌域，并通过水平基因转移（HGT）被Tardisphaera获得。编码木糖分解代谢初始步骤（木糖异构酶、木酮糖激酶）、非氧化性PPP（核酮糖磷酸3-差向异构酶、转酮酶）和几种糖酵解酶（磷酸葡萄糖/磷酸甘露糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸变位酶）的基因被预测为细菌来源。

Tardisphaerales目的比较基因组学与生态学

对Tardisphaerales两个科编码的CAZymes进行比较，发现了标志性差异。一些CAZymes在Tardisphaeraceae成员的基因组中由更多数量的基因代表（GH3、GH5和GH31），或者甚至其存在对该科是独特的（GH12、GH29、GH35、GH78、GH122、GH127和GH176）。相比之下，大多数Ca. Martarchaeaceae的基因组富含来自GH15和GH13家族的酶基因。编码某些糖苷酶（GH20、GH39、GH63和GH133）、碳水化合物酯酶（CE4和CE9）和碳水化合物氧化酶（AA7）的基因仅在Ca. Martarchaeaceae成员的基因组中发现。此外，预测的酶谱在科内有所不同：菌株MP-3918、AK-3817和MAG GCA_023256315.1拥有比其他Tardisphaeraceae成员更活跃的CAZymes集合。在Ca. Martarchaeaceae中，这些差异不太明显。大多数酶推测仅拥有单个催化结构域，分析的基因组中未编码包含来自不同CAZyme家族多个催化结构域的蛋白质。然而，存在一些具有两个相同家族催化结构域的酶（例如GH122 + GH122）或带有碳水化合物结合模块的酶（例如CBM67 + GH78和CBM48 + GH13）。此外，两个科的代表在胞外CAZymes的比例上有所不同。在Tardisphaeraceae科中，约16%的CAZymes拥有信号肽和/或跨膜区，另外48%被预测为胞外蛋白，尽管缺乏信号肽。而在Ca. Martarchaeaceae中，分别只有4%和20%的CAZymes属于这些类别。

我们对在我们的菌株中鉴定出的中心代谢途径进行了比较基因组学分析，并与先前在该目所有可用代表中预测的关键代谢酶进行了比较。它揭示所有Tardisphaeraceae都拥有spED途径，提供葡萄糖利用，而Ca. Martarchaeaceae则拥有半磷酸化和非磷酸化变体。完整的EMP途径仅在Tardisphaeraceae成员中发现。在Tardisphaeraceae科中发现了Leloir途径所有酶的同源物。相比之下，Ca. Martarchaeaceae代表缺乏编码半乳糖激酶和半乳糖变旋酶的基因，因此可能不代谢半乳糖。同源的非氧化性PPP酶在几乎所有Tardisphaerales的基因组中都有编码。木糖激酶和木糖异构酶仅在Tardisphaera基因组中发现，木糖降解可能是该目中新分离株的独特特征。

仅在Ca. Martarchaeaceae的基因组中发现了编码TCA循环所有酶的基因，而在Tardisphaeraceae中，它们被部分检测到或完全缺失。在来自Ca. Martarchaeaceae的MAGs中编码了需氧ETC的几个复合物。在所有Tardisphaerales中都发现了编码Nuo样复合物11个亚基的基因；然而，没有一个基因组编码对NAD(P)H氧化至关重要的NuoE、NuoF和NuoG亚基。此外，在Ca. Martarchaeaceae中发现了同源的fpoF基因，推测允许使用F₄₂₀H₂作为ETC中的电子供体，这与MAGs中存在F₄₂₀生物合成和代谢基因一致。Ca. Martarchaeaceae的基因组包含编码琥珀酸脱氢酶/延胡索酸还原酶的两个亚基、细胞色素bc₁复合物和细胞色素aa₃氧化酶的基因，这些共同可能构建一个完整的ETC，使其能够还原氧气并从有机物分解中保存更多能量。先前报道在Ca. Martarchaeaceae基因组中存在编码DoxAD复合物的基因，推测参与硫代硫酸盐的氧化。然而，我们的分析显示，一些Ca. Martarchaeaceae以及所有Tardisphaeraceae的基因组缺乏这些基因。值得注意的是，编码CydAA同源物的基因仅在Tardisphaeraceae中鉴定到。一些解毒系统，如饥饿期间DNA保护蛋白（Dps）、渗透诱导蛋白C（OsmC）、蛋氨酸亚砜还原酶B（MsrB）和蛋氨酸亚砜还原酶P（MsrP），在Ca. Martarchaeaceae的MAGs中观察到，但未在Tardisphaeraceae基因组组装中发现。

对隶属于Tardisphaerales目代表的16S rRNA基因扩增子、克隆文库、MAGs和宏基因组读段数据集的筛选显示，它们存在于来自俄罗斯、日本、中国、台湾、新西兰、意大利和美国酸性热泉、酸性矿山排水（AMD）和煤矸石堆沉积物的样本中。这些环境的酸度范围从1.5到5.5，温度从30到88°C。为了评估Tardisphaerales代表在环境中的丰度，我们在广泛的千岛-堪察加酸性热泉中进行了qPCR筛选，使用通用引物和特异性引物比较所有原核生物和Tardisphaerales的平均丰度。在温度范围41.7°C至69°C、pH 1.5–5.5的泉水中检测到Tardisphaerales代表。通过qPCR和NGS数据估算的Tardisphaerales在微生物群落中的比例相似，占0.8%–40.7%，在pH <3的热泉中值最高。

Tardisphaera miroshnichenkoae 和 Tardisphaera saccharovorans 的描述

基于系统发育分析和表型特性，菌株MP-3918和AK-3817代表了Thermoproteota内的一个新谱系。我们提议将其分类为两个新种，Tardisphaera miroshnichenkoae sp. nov.（模式菌株MP-3918^T = VKM B-3629^T = CGMCC 1.18048^T）和Tardisphaera saccharovorans sp. nov.（模式菌株AK-3817^T = VKM B-3679^T = CGMCC 1.18047^T），隶属于一个新属Tardisphaera gen. nov.，该属构成了新科Tardisphaeraceae fam. nov.和新目Tardisphaerales ord. nov.的模式属。与未培养的Ca. Geoarchaeales一起，该目在Thermoproteota门内形成了一个 distinct 的纲，此处提议为Tardisphaeria class. nov.。

(Tardisphaera gen. nov. [Tar.di.sphae'ra. L. masc. adj. tardus, 慢; L. fem. n. sphaera, 球体; N.L. fem. n. Tardisphaera, 生长缓慢的球形生物]。模式种是T. miroshnichenkoae)。

(T. miroshnichenkoae sp. nov. [mi.rosh.ni.chen’ko.ae; N.L. gen. fem. n. miroshnichenkoae, 以俄罗斯微生物学家Margarita Miroshnichenko的名字命名，以表彰她对微生物分类学和嗜极微生物研究的贡献]。模式菌株是MP-3918^T=VKM B-3629^T=CGMCC 1.18048^T，分离自国后岛[千岛群岛]的硫质喷气孔)。

(T. saccharovorans sp. nov. [sac.cha.ro.vo’rans;