PHB驱动的代谢适应：转录调节因子AniA（PhaR）结合PHB调控的系统水平解析

本综述系统解析了PHB结合转录调节因子PhaR（AniA）在根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）中通过多组学整合分析（包括共表达网络、蛋白质组学、启动子报告系统及DNA结合实验）揭示的双重功能：作为代谢传感器响应PHB积累状态，并作为全局调节因子调控碳代谢中心途径（如Entner-Doudoroff通路、TCA循环、丙酮酸代谢）和胞外多糖（EPS）合成等关键生物学过程，为理解细菌碳储存与代谢适应性提供了新视角。

　　

ABSTRACT

聚羟基丁酸酯（PHB）是一种碳和能量储存聚合物，在营养失衡且碳源过剩的条件下常见于细菌中积累。PhaR是一种保守的转录调节因子，在多个物种中与PHB颗粒结合。尽管其在调节PHB储存和代谢中的作用已在细菌系统发育中广泛研究，但缺乏对PhaR作为代谢传感器和调节因子的双重功能的系统水平观点。本研究在自由生活状态下积累PHB的α-变形杆菌根瘤共生体苜蓿根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）中，整合了共表达网络分析与多个突变背景（缺乏PhaR [AniA]和/或PHB合成）下的蛋白质组分析。通过以调节子为中心的计算多步搜索DNA结合位点 motif，结合PhaR-DNA结合和启动子报告实验，识别PhaR的直接调控靶点，丰富了这一分析。我们证实了积累的PHB隔离PhaR，从而解除phasin和PHB解聚酶基因的抑制以控制细胞PHB水平的模型也适用于苜蓿根瘤菌，并表明PhaR介导的调控也发生在共生状态。我们对PHB介导的PhaR滴定对细胞功能影响的整合分析揭示了胞外多糖生产以及中心碳代谢（pdh和bkd）、糖异生（ppdK和pyc）、进入TCA循环（gltA）和Entner-Doudoroff（ED）途径的初始步骤（zwf、pgl和edd）作为主要调控靶点，以及功能未知的靶基因。我们的发现突出了PhaR在协调碳代谢中的关键作用。

IMPORTANCE

聚羟基丁酸酯（PHB）是一种碳和能量储存聚合物，通常与细菌在营养限制条件下的生存相关。其积累反映了细胞代谢平衡，转录调节因子PhaR已被证明结合PHB并控制其代谢相关基因的表达。同时，PhaR已被涉及影响全局基因表达的更广泛调控作用，尽管这一功能与其感知PHB能力之间的联系仍未解决。在本研究中，我们使用模型豆科植物共生体苜蓿根瘤菌来弥合这一差距。我们证明PhaR响应由PHB积累信号指示的代谢状态来调节全局基因表达。我们的发现强调PHB不仅作为一种储存化合物，而且是代谢状态的关键整合器，将营养可用性与协调的转录反应联系起来。

INTRODUCTION

聚羟基丁酸酯（PHB）是一种储存聚合物，以细胞内颗粒的形式被许多细菌物种积累，称为碳体。在生长限制条件下且如果有可利用的碳源可用，PHB通过PHB合酶将β-羟基丁酰残基聚合而合成。该过程始于两个乙酰辅酶A分子缩合形成乙酰乙酰辅酶A，随后通过NAD(P)H还原为β-羟基丁酰辅酶A。这些步骤分别由β-酮硫解酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶催化。PHB被PHB解聚酶降解，产物被修饰产生乙酰辅酶A和还原的氧化还原辅酶。PHB颗粒表面被phasins屏蔽免受细菌细胞质的影响；其他PHB颗粒相关蛋白包括PHB合酶和解聚酶以及一种在许多物种中称为PhaR的转录调节因子。

在PHB生物合成的模式生物β-变形杆菌Cupriavidus necator（以前称为Ralstonia eutropha）中，PhaR已被证明抑制编码phasins的基因的转录。当不生产PHB时，PhaR作为转录抑制子，当PHB积累时，PhaR被隔离到PHB颗粒表面远离DNA，从而确保phasin丰度相对于产生的PHB受到严格调控。在α-变形杆菌中也鉴定了PhaR同源物的类似功能；在Rhodobacter sphaeroides和Paracoccus denitrificans中，PhaR也抑制phasin基因表达。证实了R. sphaeroides PhaR结合DNA的能力，并结合序列确定为5′-CTGCNNNGCAG-3′。在Paracoccus denitrificans中记录了PhaR与PHB的体外结合。在α-变形杆菌根瘤菌Rhizobium etli和Bradyrhizobium diazoefficiens中，已鉴定的PhaR同源物被显示在基因表达控制中具有更广泛的作用。

尽管在理解PhaR功能方面取得了这些进展，但尚未有研究提供PhaR调节子在其作为代谢传感器和调节因子的双重角色背景下的高分辨率全局分析。为了填补这一空白，我们设计了一种方法，结合共表达网络分析与使用模型共生土壤居住α-变形杆菌苜蓿根瘤菌在多个突变背景下的蛋白质组学。在苜蓿根瘤菌中，染色体编码的phaR同源物最初被鉴定并命名为aniA（用于厌氧诱导基因A；为一致性，在我们的研究中重命名为phaR）。苜蓿根瘤菌与Melilotus、Medicago和Trigonella属豆科植物的共生导致不确定根瘤的形成，其中定植细菌要么以营养状态存在，要么作为分化的固氮类菌体存在。共生的建立是一个复杂的多步骤过程，涉及信号传导和适应。苜蓿根瘤菌广泛的遗传、表型和分子特征，结合对其自由生活和共生生活方式代谢的先进全局理解，使其成为在分子系统水平探索PhaR（AniA）双重作用的理想模型。

苜蓿根瘤菌将过量碳储存为细胞内PHB颗粒作为其主要碳储存化合物，并且其PHB代谢组已被广泛研究。 Phasins PhaP1（SMc00777）和PhaP2（SMc02111）被鉴定为颗粒相关蛋白，是有效PHB积累所必需的。在自由生活条件下活跃的PHB代谢已被证明在调节氮代谢基因表达中起关键作用，可能通过涉及Fnr型转录因子。 Ratcliff和Denison的研究探索了PHB在赌注对冲和持久性中的作用，证明了在苜蓿根瘤菌中营养限制下PHB颗粒在母细胞和子细胞之间的不对称分布。在共生中，PHB在感染早期积累，但在固氮类菌体中未观察到PHB颗粒。

苜蓿根瘤菌PhaR与来自α-和β-变形杆菌的研究的PhaR同源物共享39%至83%的氨基酸相似性。苜蓿根瘤菌Rm41中phaR（aniA）的突变减少了PHB积累，同时增加了糖原和胞外多糖（EPS）生产。此外，当丙酮酸用作唯一碳源时，该突变缓解了phbC突变体中的生长缺陷。在R. etli phaR（aniA）突变体中的类似发现证实了该基因在共生根瘤菌中的保守功能。此外，苜蓿根瘤菌中phaR的耗尽导致小RNA MmgR的过量生产，这可能通过phasin基因表达的转录后抑制来微调PHB积累。因此，功能性PhaR可能在PHB合成开始时对适当的phasin生产至关重要。虽然产生PHB的能力对苜蓿根瘤菌的共生性能并不关键，但PhaR在共生相互作用的早期阶段提供了竞争优势。除了PHB，苜蓿根瘤菌还积累糖原并产生琥珀酰聚糖（EPSI）和半乳葡聚糖（EPSII）的胞外多糖，这些在共生过程中具有关键作用。

我们的研究通过系统水平分析提供了对苜蓿根瘤菌中PhaR调节子的广泛而深入的见解。我们通过揭示先前未检测到的扩展AT丰富臂并描述PHB代谢组中保守的PhaR调控靶点、可能保守但尚未在携带PhaR的细菌中报道的新靶点以及系统发育相关细菌中靶点的变异，推进了对PhaR DNA结合位点的知识。我们报告了支持PhaR在调节中心碳和EPS代谢关键步骤中的作用的蛋白质组、生化和表型证据，与其先前提出的在营养失衡下协调碳命运的作用一致，并暗示了超出中间代谢的更广泛调控作用。我们的共表达网络分析揭示，PhaR通过结合其进化保守的结合DNA和PHB的能力，作为代谢传感器和全局基因调节因子发挥作用。

MATERIALS AND METHODS

菌株、质粒和生长条件

本研究中使用的菌株和质粒列于表1。用于克隆和接合的大肠杆菌在37°C于溶原性肉汤（LB）培养基（10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，5 g/L NaCl）中生长。需要时，添加卡那霉素（50 mg/L）或四环素（10 mg/L）。苜蓿根瘤菌在30°C于TY培养基（5 g/L胰蛋白胨，3 g/L酵母提取物，0.4 g/L CaCl₂.2H₂O）或3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）缓冲的磷酸限制最小培养基（进一步称为低P培养基）中培养。在液体培养中，抗生素浓度减半。

克隆和遗传操作

本工作中使用的构建体使用标准遗传技术生成。质粒通过与大