PhaR作为代谢传感器与全局调控因子协调苜蓿根瘤菌碳代谢网络的系统生物学研究

本综述系统阐述了转录调节因子PhaR（Polyhydroxybutyrate regulator）在苜蓿根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）中作为新型代谢传感器的双重功能。研究通过整合共表达网络分析、蛋白质组学和多突变体验证，揭示PhaR通过感知聚羟基丁酸酯（PHB）积累状态，动态调控碳存储代谢（如phasin基因和PHB解聚酶）、外多糖（EPS）合成及中心碳代谢途径（包括Entner-Doudoroff通路、TCA循环和丙酮酸代谢）。该发现深化了对细菌碳分配调控机制的理解，为微生物代谢工程提供了新靶点。

　　

引言

聚羟基丁酸酯（PHB）是许多细菌在碳源过剩且营养受限条件下合成的胞内碳存储聚合物。其代谢过程涉及PHB合酶催化的β-羟基丁酰基聚合反应，以及PHB解聚酶介导的降解过程。PHB颗粒表面由phasin蛋白包裹，并附着多种功能蛋白，包括转录调节因子PhaR。在模式菌株Cupriavidus necator中，PhaR被证实可抑制phasin基因转录，并通过与PHB颗粒结合实现解离抑制的调控机制。类似功能在α-蛋白酶菌如Rhodobacter sphaeroides和Paracoccus denitrificans中也被发现。然而，关于PhaR如何协调代谢感知与全局基因调控的系统性研究仍属空白。

材料与方法

本研究以苜蓿根瘤菌Sinorhizobium meliloti为模型，构建了phaR和phbC的单双突变株，并在低磷酸盐（低P）和TY培养基中培养以调控PHB积累状态。通过定量蛋白质组学、共表达网络分析（hoCoCena包）和启动子-报告基因（EGFP）融合实验评估基因表达变化。采用体外PHB结合实验和电泳迁移率变动分析（EMSA）验证PhaR与PHB及DNA的互作。共生表型通过苜蓿（Medicago sativa）结瘤实验评估。

结果

PhaR与PHB的互作验证

纯化His₆-PhaR蛋白在体外可特异性结合结晶PHB，约10 μg蛋白（440 pmol）可结合1 μg PHB。通过PhaP1-EGFP和PhaR-EGFP的荧光共定位时间序列成像，证实PhaR在体内被招募至PHB颗粒表面。PHB定量显示，低P培养基中phaR突变体的PHB积累量降低30%，而TY培养基中所有菌株均无显著PHB合成。

共生表型与调控活性

尽管phaR和phbC突变不影响结瘤数和植物生物量，但结节切片荧光成像显示，phaR突变体中PhaP1-EGFP信号显著增强，表明PhaR在共生状态下仍保持对phasin基因的转录抑制功能。

蛋白质组与共表达网络分析

主成分分析表明，PhaR对蛋白质组的调控效应在PHB缺失条件下（如phbC突变体或TY培养基）最为显著。共表达网络识别出10个模块，其中模块1-3富含受PhaR抑制的蛋白（如phasins、PHB解聚酶SMa1961、EPS合成酶ExoY/ExoL等），模块4-6则包含受PhaR激活的蛋白（如丙酮酸脱氢酶Pdh、支链酮酸脱氢酶Bkd、卡尔文循环酶CbbF/P/T等）。模块1中的中心碳代谢酶（如柠檬酸合酶GltA、磷酸葡萄糖酸脱水酶Edd）和模块6中的膜转运蛋白（如ABC转运体）均受PhaR显著调控。

PhaR结合 motif 的扩展鉴定

通过 regulon-centric MEME 分析，发现PhaR结合 motif 为WNWD₂NYGCRNYGCRNH₂WNW（其中W=A/T, D=A/G/T, H=A/C/T, R=A/G, Y=C/T），该序列在50个启动子区域中存在，包括phaP1、phaP2、exoH、ppdK等基因上游。EMSA实验证实PhaR可直接结合含该motif的启动子片段。

讨论

本研究系统揭示了PhaR通过感知PHB积累状态，动态调控碳代谢网络的双重功能：一方面通过抑制phasin和PHB解聚酶基因维持PHB代谢平衡，另一方面通过激活α-酮酸脱氢酶复合体（pdh、bkd）和卡尔文循环酶协调中心碳代谢。此外，PhaR对EPS合成基因的抑制暗示其参与碳源分配决策。扩展的AT-rich motif鉴定为理解PhaR的DNA结合特异性提供了新见解。这些发现凸显了PHB不仅是存储化合物，更是代谢状态的核心指示器，连接营养可用性与转录响应。