胃窦与胃体来源幽门螺杆菌临床分离株的区域特异性基因组变异与功能分化研究

本研究发现，从同一患者胃窦和胃体分离的幽门螺杆菌（H. pylori）临床株存在显著的基因组异质性和功能分化。研究通过全基因组测序（WGS）和功能实验证实，胃体来源菌株（如v226/v291）表现出更强的粘附能力、CagA（细胞毒素相关基因A）易位及磷酸化活性，并诱导更高的白细胞介素-8（IL-8）分泌；而胃窦来源菌株（如v225/v290）则呈现更高的空泡毒素（VacA）活性和细胞侵袭力。这些发现揭示了H. pylori在胃内不同生态位的适应性进化机制，为理解其致病性差异和开发区域特异性治疗策略提供了重要依据。

　　

比较临床幽门螺杆菌分离株的全基因组和毒力基因分析

研究团队对从两名消化性溃疡患者的胃窦和胃体区域分离的两对幽门螺杆菌菌株（v225/v226和v290/v291）进行了全基因组测序、从头组装和比较基因组分析。通过Mauve软件与参考菌株26695进行比较，发现这两对菌株之间存在保守基因，但同时也存在结构变异。全基因组平均核苷酸一致性（ANI）分析显示，v225与v226的ANI为99.98%，v290与v291的ANI为99.42%，表明每对菌株具有高度基因组相似性，很可能来源于同一祖先菌株，并在特定生态位中发生了微进化分化。

进一步对毒力基因的注释和比较发现，v290是唯一缺失sabA/hopP、sabB/hopO、α-(1,2)-岩藻糖基转移酶（futA）及某些未确定毒力因子的菌株。这些基因的缺失可能影响细菌的粘附能力和宿主免疫逃逸机制。

幽门螺杆菌分离株中毒力基因的异质性

尽管临床分离株的整个毒力基因组并未完全缺失，但菌株间在关键毒力基因序列上存在细微差异。这些差异可能影响幽门螺杆菌的致病性。通过多序列比对分析粘附基因（hop家族）、脲酶基因、毒素基因（如cag-PAI和vacA）以及免疫逃逸蛋白（如capJ、cgat等），发现重要的粘附分子基因（如sabA和babA/B）仅在v290/v291这对菌株中存在显著差异。例如，sabA仅在v291中存在，而v290和v291的babA和babB相似性分别为63%和59%。此外，两对菌株的cag-PAI基因一致性均超过90%，vacA基因的一致性分别为93%和89%。

临床分离株中粘附基因的变异

成功粘附胃上皮细胞是幽门螺杆菌致病性的关键初始步骤。粘附分子对于细菌入侵人类胃上皮细胞至关重要。因此，研究团队进一步分析了与粘附相关的hop家族基因。与参考菌株26695相比，v290/v291在sabA和babA/B上存在显著差异。v290是唯一在其基因组中缺失sabA基因的菌株。然而，v225/v226这对菌株在粘附相关基因的表达上未发现显著差异。此外，v225和v226在babA/B上存在大片段缺失，而在v290/v291中，v291保留了完整的babA/B基因，而v290则表现出大片段缺失。

配对分离株间不同的细菌粘附和侵袭活性

鉴于两对幽门螺杆菌分离株在sabA和babA/B基因序列上存在细微差异或大片段缺失，先前研究表明SabA和BabA调控之间的平衡是幽门螺杆菌启动定植并持续建立慢性感染的关键因素。为了探讨不同粘附相关基因的存在是否影响幽门螺杆菌的致病性，研究团队比较了两对分离株的粘附和侵袭活性。结果显示，胃体来源菌株（v226和v291）的粘附能力强于胃窦来源菌株（v225和v290）。此外，对v291菌株粘附相关基因的遗传分析显示其完整性高于v290菌株。然而，v225和v226在粘附基因上无显著差异。随后，研究团队探讨了临床分离株侵袭人胃上皮细胞的能力，发现胃窦来源菌株v225和v290的内化活性高于胃体来源菌株v226和v291。

幽门螺杆菌临床分离株中cag-PAI基因簇的多样性

CagA是幽门螺杆菌最危险的毒力因子之一，其毒性活性主要依赖于细菌IV型分泌系统（T4SS）的识别。T4SS的组成基因和cagA基因主要由cag-PAI编码。因此，研究团队分析了幽门螺杆菌分离株中的cag-PAI基因簇，以确定是否存在编码T4SS和CagA的基因差异。与参考菌株相比，v225和v226在两个假设基因的身份上表现出显著差异，这些基因附近是cagQ、cagP、cagC和cagA。然而，在v290和v291中，这些基因的身份并无显著差异。尽管这些假设基因的功能未知，但它们可能影响邻近基因的表达。幽门螺杆菌CagA EPIYA基序变体差异性地激活宿主细胞信号通路，从而对胃癌发生有不同的贡献。因此，研究团队重点关注了CagA的EPIYA基序，分为西方CagA（常见类型为ABC）和东方CagA（常见类型为ABD）。所有分离株均表达东方型EPIYA-ABD，且无显著差异。

临床分离株中CagA诱导的不同反应

观察到胃体和胃窦生态位以及分离株粘附和侵袭活性的差异后，研究团队进一步检验了来自不同菌株的CagA对人胃上皮细胞的影响。对分离株中磷酸化CagA水平的分析显示，v225和v226的磷酸化CagA水平相当，而v290和v291存在差异，v291的磷酸化CagA水平高于v290。为了确定不同分离株中CagA是否对人胃上皮细胞有显著影响，研究使用蜂鸟表型作为成功易位幽门螺杆菌CagA的生物标志物。与胃窦来源菌株v225和v290相比，胃体来源菌株v226和v291诱导蜂鸟表型的能力更强。胃上皮细胞是抵御病原体的第一道防线。在致病过程中，幽门螺杆菌严重损伤细胞，胃上皮细胞分泌促炎细胞因子白细胞介素-8（IL-8）。与伸长细胞百分比一致，胃体来源菌株诱导的IL-8产量高于胃窦来源菌株。

临床分离株中vacA的异质性

vacA序列的差异导致细胞产生空泡化的能力不同。因此，研究团队对v225/v226和v290/v291临床对进行了多序列比对，以分析两对分离株间vacA序列的差异。发现从胃窦分离的v225和v290菌株的vacA m区与从胃体分离的v226和v291菌株有显著不同。v225和v290具有嵌合型（m1T/m2），而v226和v291的m区为m2型。

不同的vacA赋予幽门螺杆菌在胃上皮细胞中诱导 distinct 空泡化

研究团队使用 established 中性红试验检验了分离株间vacA序列的差异是否对胃上皮细胞的空泡化活性有不同的影响。结果显示，v225和v290的空泡化活性高于v226和v291。结果表明，嵌合型（m1T/m2）在胃窦分离菌株（v225和v290）中比在胃体菌株（v226和v291）中产生更高的毒性。这些发现表明，幽门螺杆菌在同一宿主体内表现出相当大的遗传多样性，特别是在胃窦和胃体区域之间。CagA和VacA等毒力因子的这种多样性导致胃上皮细胞致病性的不同程度。

讨论

为了实现成功的致病性，幽门螺杆菌的毒力因子在调节宿主免疫系统和诱导炎症反应中发挥 instrument 作用。来自胃不同区域的幽门螺杆菌分离株表现出核苷酸多态性，使它们能够通过特定的毒力因子引起严重疾病。我们之前的研究强调了从胃窦和胃体分离的幽门螺杆菌菌株的遗传变异。通过随机扩增多态性DNA（RAPD）和序列分析，该研究进一步验证了来自这两个胃部位的分离株间vacA的嵌合现象。然而，全基因组测序和这些临床分离株的致病性尚未得到彻底探索。在本研究中，全基因组测序全面识别了菌株对之间的遗传差异。我们的结果显示，来自同一宿主胃窦和胃体的菌株具有高度的基因组一致性（>99%），支持微进化分化而非 distinct 克隆定植的假设。我们的发现揭示了来自同一宿主不同胃区域的幽门螺杆菌菌株之间存在显著的遗传多样性。这种多样性 actively contributes to 幽门螺杆菌表达 distinct 毒力因子，这些因子在影响致病结果中起 pivotal 作用。

组织学分析显示，混合幽门螺杆菌感染患者与单一菌株感染患者在胃窦和胃体变化上存在显著差异。混合感染患者胃窦肠上皮化生的 incidence 明显高于单一感染患者。从单一宿主获得的幽门螺杆菌菌株在毒力因子和抗生素耐药模式上表现出变异。此外，据报道，混合幽门螺杆菌感染的 prevalence 在十二指肠溃疡患者中显著高于其他胃肠道疾病患者。这些证据表明，混合幽门螺杆菌感染可能增强细菌对严酷胃环境的适应性， contribute to 疾病进展。

幽门螺杆菌临床分离株的基因组分析已识别出细菌基因多态性与特定胃生态位之间的 associations。这些结果表明，趋化性、调节功能和 outer membrane 蛋白在幽门螺杆菌适应胃窦和泌酸黏膜中起 crucial 作用。最近，深度群体和单菌落分离株测序揭示了幽门螺杆菌在胃窦和胃体区域内部和 between 细菌群体中的普遍多样性。这种多样性与细菌毒力和定植密切相关。总的来说，这些发现突出了使幽门螺杆菌能够在来自不同患者的多个分离株中定植 distinct 胃环境的适应性机制。

越来越 evident that 幽门螺杆菌产生的各种毒力因子可以促进在宿主生态位内的 establishment。我们最近的发现强调了这些毒力因子如何激活宿主先天感应机制，从而促进胃上皮细胞的炎症。幽门螺杆菌菌株间的基因组变异性与疾病 occurrence 和进展密切相关， mainly through 毒力因子的遗传变异。这些毒力因子致病性的差异，特别是那些含有cagA和vacA s1m1的因子，与疾病发展的高风险相关。在胃的不同部位观察到了毒力因子的遗传变异。宿主免疫反应可以驱动幽门螺杆菌的遗传异质性，定植在不同胃区域的菌株面临 distinct 选择压力，如pH水平或免疫防御的 variations。这些条件导致适应性突变或 distinct 遗传重排，使细菌更适应恶劣环境。

关于粘附因子sabA/B和babA/B，先前的研究报道babA进化 adaptively 以在更酸性的环境中增强粘附。尽管在我们的遗传分析中仅在v290/v291对中观察到babA的序列差异，但从胃更酸性区域（胃体）分离的v226和v291菌株在体外实验中表现出更高的粘附活性。我们假设这种增强的粘附可能有助于细菌更好地隐藏在胃黏膜下，这一假设得到早期发现的支持，即粘附因子结合人胃中的各种抗原。这种结合在 persistent 感染中起 crucial 作用，并通过T4SS增强CagA易位，导致胃上皮细胞损伤。

CagA与VacA表现出相互拮抗作用，尽管这种功能拮抗的确切 underlying 机制仍不清楚。细胞 rarely 同时表现出空泡化和蜂鸟表型，因为VacA和CagA downregulate 彼此对胃上皮细胞的影响。在本研究中，与胃体菌株（v226和v291）相比，表现出更强空泡化活性的胃窦菌株（v225和v290）显示出较弱的CagA诱导形态变化和减少的IL-8释放，为VacA和CagA之间的相互拮抗提供了证据。此外，具有更强粘附活性的v226和v291表现出更高的CagA易位和磷酸化活性， confirming that 幽门螺杆菌粘附 contributes to CagA活性。尽管在本研究中观察到了CagA和VacA之间的功能拮抗，但其 underlying 分子机制仍有待 fully 阐明，值得进一步研究。

结论

我们的研究表明，从同一患者胃窦和胃体分离的幽门螺杆菌菌株表现出显著的遗传异质性，特别是在粘附相关基因和关键毒力因子（如cagA、vacA和cag-PAI）上。全基因组测序（WGS）和比较分析揭示了区域特异性基因型差异，这些差异转化为胃上皮细胞中 distinct 功能结果。胃体来源菌株显示出增强的粘附、CagA易位和磷酸化以及IL-8诱导，表明其更具促炎 profile，而胃窦来源菌株诱导更高的VacA介导的空泡化。这些发现强调了考虑宿主内幽门螺杆菌多样性在致病性中的重要性，并表明菌株特征的空间变异可能影响疾病进展和治疗策略。