综述：透过镜子看：可视化Bdellovibrio及类似生物生命周期的方法

本综述系统回顾了用于研究Bdellovibrio及类似生物（BALOs）生命周期的显微技术进展，涵盖了从传统（相衬、电子显微）到现代（荧光、冷冻电镜）的多种方法，重点介绍了这些技术在解析捕食者-猎物互作机制（如侵入过程、bdelloplast形成及表捕食策略）中的应用，并强调了其对理解微生物捕食行为的贡献。

　　

引言

显微镜技术一直是研究具有发育生命周期细菌结构和生长的重要工具，原核捕食者也不例外。20世纪60年代，研究人员利用相衬光学显微镜和透射电子显微镜描述了第一个Bdellovibrio及类似生物（BALOs）——Bdellovibrio bacteriovorus。时至今日，新的原核捕食者仍在不断被分离出来，同时，显微镜新技术的出现使得研究者能够对BALOs的周质和表捕食生命周期提出更根本的问题。

猎物细胞选择

Bdellovibrio bacteriovorus的偶然发现源于Stolp从土壤中寻找针对植物病原假单胞菌的裂解性病毒（噬菌体）。与噬菌体不同，大多数BALOs具有广泛的猎物范围，研究者可以根据自己的研究兴趣定制猎物细胞的选择。早期研究多使用少数几种捕食者菌株，并以Escherichia coli B或ML35作为宿主细胞。猎物细胞的大小会影响BALOs后代的数量，这在以Aquaspirillum serpens（比Escherichia coli更大）为猎物的研究中得到证实。近年来，研究使用的猎物已扩展到包括农业病原体、人类病原体（特别是多重耐药物种和生物膜）以及用于研究咸水BALOs的Vibrio parahemolyticus。对于表捕食者Pseudobdellovibrio exovorus JSS，已确定的易感猎物物种相对较少，包括Caulobacter crescentus和Stenotrophomonas maltophilia等。

光学显微镜

相衬显微镜从研究伊始就是研究bdellovibrios不可或缺的工具，至今仍然如此，并且对于没有电子显微镜专业知识或使用权限的研究者来说是无价之宝。它允许研究者探究BALOs生命周期的各个方面，并观察捕食者动态和独特的生长特性。例如，它被用于评估Bdellovibrio bacteriovorus 109J的fliC3突变体的运动性，以及同步宿主依赖和非依赖培养物。

延时显微镜技术提供了对捕食生命周期关键阶段（如猎物进入、伸长、分裂和释放）的实时观察。该技术的一个主要优点是能够追踪单个细胞在整个捕食周期中的情况，并量化各阶段之间的特定时间间隔。研究通过延时成像证实了此前假设但未最终证实的生命周期事件，并用于研究特定基因（如肽聚糖水解酶基因bd1075、裂解酶基因bd0314、bd1413、bd1440和bd1411）在捕食过程中的功能，揭示了捕食细菌的基因组可塑性及其对一系列基因的依赖。

电子显微镜

透射电子显微镜（TEM）

对于新的BALOs分离株，一个好的研究方法是进行负染并检查细胞形态，寻找具有阻尼波形（damped waveform）的鞘状鞭毛，这是BALOs的指示特征。醋酸铀（1%， pH 4.4）能提供良好的结构保存。虽然也可以通过负染观察bdelloplast，但其结构通常染色过深、颜色暗，且细胞内的捕食者不清晰。通常，通过共培养细胞的薄切片用TEM可以更好地观察bdelloplast，该技术为BALOs捕食者的周质生命周期提供了无可争议的证据。观察BALO实际进入猎物细胞的过程证实了周质生命周期。表捕食者Pseudobdellovibrio exovorus的生命周期也是在与Caulobacter crescentus共培养的薄切片中确定的。

扫描电子显微镜（SEM）

扫描电子显微镜（SEM）可用于确定攻击期BALO的形状，但在样品制备过程中鞭毛可能会丢失，阻尼波形也不能很好地保存。SEM有助于识别BALOs周质生命周期的各个阶段，Bdellovibrio bacteriovorus的bdelloplast在SEM下显示为圆形、起皱的实体。在描述BALOs的新分类单元时，必须通过TEM薄切片或荧光显微镜验证bdelloplast的存在。

SEM在研究表捕食者时也很有用。在描述Pseudobdellovibrio exovorus JSS时，显示了捕食者附着在带柄的Caulobacter crescentus猎物细胞上，并观察到了由于捕食作用导致的这些猎物细胞的抽空和塌陷。必须注意的是，如果没有通过其他可视化技术（如TEM薄片或相衬显微镜）获得关于表捕食生命周期的先验知识，通过SEM观察到的幽灵细胞可能难以辨认。

SEM是研究BALOs捕食行为对非生物表面和生物膜影响的良好工具。研究利用SEM监测了Bdellovibrio分离株从不锈钢表面清除病原菌的情况，证明了Bdellovibrio bacteriovorus 109J减少预先存在的Escherichia coli和Pseudomonas fluorescens生物膜的能力，确定了PilT2对于在Escherichia coli生物膜上进行捕食至关重要，并证实了Bdellovibrio bacteriovorus预防多种病原体（包括一些革兰氏阳性病原体）形成生物膜的能力。

冷冻电子显微镜（Cryo-EM）

冷冻电子显微镜（Cryo-EM）已成为微生物学领域的变革性工具，以近原子分辨率提供了对细胞结构及其相互作用的空前洞察。与TEM技术不同，Cryo-EM涉及将生物样品快速冷冻在玻璃态中，无需化学固定或染色即可保留其天然结构。这种方法最大限度地减少了伪影，并允许可视化其自然环境中的微妙和动态分子组装体。对于BALOs的研究，Cryo-EM在解析捕食者-猎物相互作用的复杂结构细节方面提供了独特优势。

Cryo-EM图像首次展示了Bdellovibrio bacteriovorus HD100攻击期细胞的“高度弯曲结构”，细胞非常灵活，可以发生剧烈的形状变化，并观察到内膜和外膜的局部变形而不会丧失细胞完整性。最近，研究确定了一种肽聚糖水解酶Bd1075，它会产生Bdellovibrio bacteriovorus的细胞弯曲度。该酶在所有菌株中都是保守的，除了109J（它有一个57个氨基酸的框内截短），因此它是非弧菌形的。据报道，杆状捕食者（HD100 Δbd1075）侵入猎物的速度比弯曲的野生型慢。这些观察结果证实形状有助于捕食适应性。

最近，通过Cryo-EM表征了Bdellovibrio bacteriovorus HD100的周质生命周期和Pseudobdellovibrio exovorus JSS的表捕食生命周期。Cryo-EM清楚地表明，Bdellovibrio bacteriovorus 109J在入侵之前就开始修改猎物细胞的内部生态位，猎物细胞的细胞质膜与其细胞壁的紧密关联丧失，周质空间开始增加。当周质空间形成足够的体积时，Bdellovibrio bacteriovorus 109J开始挤过猎物细胞壁上的孔。在入侵过程中观察到捕食者的收缩，但这是短暂的，因为在随后猎物细胞内的伸长捕食者中从未观察到这种情况。

随着捕食者在bdelloplast内生长，对bdelloplast细胞壁的化学修饰增加了结构的可塑性，使其能够适应外部压力。生长完成后，丝状体同时发生多次分裂。

Pseudobdellovibrio exovorus JSS在Caulobacter crescentus上的表捕食生命周期也通过Cryo-EM进行了检查。观察到Pseudobdellovibrio exovorus JSS附着在柄细胞和游动细胞上，偶尔也观察到附着在分裂前细胞上。在捕食过程中，观察到猎物细胞质内容的丢失，导致周质空间增加，猎物细胞的原生质体向捕食者收缩。捕食持续进行，直到没有足够的猎物细胞质内容来允许进一步分裂。Pseudobdellovibrio exovorus的分裂发生在捕食者仍然附着在猎物细胞上时。表捕食的最终结果是形成一个空的“幽灵”猎物细胞，它保留了猎物细胞的原始形状。

荧光显微镜

荧光显微镜已广泛应用于研究BALOs的生命周期和检测。荧光团可以直接标记捕食者或猎物细胞的成分，如DNA或蛋白质，并有助于区分捕食者和猎物。在复杂的群落中，可视化bdelloplast可能难以辨别。荧光标记使得在错综复杂的环境（包括多物种共培养、生物膜和哺乳动物细胞）中区分细胞变得更加容易。此外，随着活细胞追踪软件与荧光显微镜结合技术的进步，可以追踪捕食者猎物相互作用，从而更深入地了解BALO生命周期。

活/死染色（Live/Dead Staining）

确定细胞活力是检查BALO生命周期的关键。基于细胞膜通透性的差异，活/死染色技术使用两种染料（通常是SYTO 9和碘化丙啶（PI））。SYTO 9作为活体染料可以穿透并染色活细胞，而PI只能穿透受损的细胞膜，通常是在细胞死亡后。活/死染色主要用于清晰区分捕食者和猎物细胞，并监测bdelloplast内捕食者的存活率。

活/死染色在分析复杂环境（如生物膜）中的存活率时也非常宝贵。研究调查了Bdellovibrio bacteriovorus对Escherichia coli和Pseudomonas fluorescens生物膜的影响，以及这些环境是否易受Bdellovibrio bacteriovorus攻击。通过活/死染色和成像，他们可以在接种48小时后根据PI荧光信号的增加来确定这些结构内成功的捕食。

突变的影响，特别是对负责猎物附着和入侵的基因，可以通过活/死染色可视化。最近，发现MIDAS（金属离子依赖性粘附位点）蛋白家族中的一种表面蛋白（Bd0875）在捕食者和猎物之间的侵入性相互作用中扮演重要角色。缺乏Bd0875的Bdellovibrio bacteriovorus菌株会杀死Escherichia coli，形成bdelloplast结构；然而，它没有入侵猎物细胞。通过SYTO 9染色的Bdellovibrio bacteriovorus未在bdelloplast内观察到，但通过PI染色证实Escherichia coli已死亡。该研究进一步使用免疫荧光显微镜证实了Bd0875在攻击期Bdellovibrio bacteriovorus表面的存在，展示了两种不同荧光显微镜技术在确定蛋白质定位和功能方面的协同作用。

荧光原位杂交（FISH）

荧光原位杂交（FISH）是一种通过用户设计的荧光DNA探针与其靶标杂交来识别环境样品中物种的方法。FISH已广泛应用于微生物学中，以确定细菌在组织、环境样品或生物膜等中的定位。与PCR引物设计类似，探针可以设计成具有不同水平的特异性，范围从所有细菌到特定的属或种水平识别。

为了分离BALOs，必须对捕食者进行富集，这阻碍了识别样品中BALOs的真实丰度。为了规避这个问题，研究使用BALO特异性的FISH探针筛选环境样品；然而，由于它们在样品中的丰度较低，仍然需要富集。后续研究扩展了这项技术。