马铃薯疮痂病菌株间互作及其对木栓质降解的适应性机制研究

本文系统比较了三种马铃薯疮痂病致病链霉菌（Streptomyces scabies、S. acidiscabies和S. turgidiscabies）对马铃薯块茎周皮木栓质（suberin）的降解能力，揭示了S. scabies 87.22通过高表达纤维素酶（cellulase）和酯酶（esterase）活性、高效降解木栓质芳香族组分（trans-ferulic acid和p-coumaric acid）的独特适应性优势，并首次发现S. acidiscabies产生的抗生素oxanthromicin在种间竞争中的抑制作用，为疮痂病生态防控策略提供了新视角。

　　

Interactions between common scab-inducing strains on potato suberin

Abstract

马铃薯块茎周皮被木栓质（suberin）所 armor，该生物聚合物由脂肪族结构域（aliphatic domain，脂肪酸聚酯）和芳香族结构域（aromatic domain，肉桂酸衍生物）组成。本研究比较了主要致病菌Streptomyces scabies 87.22与新兴病原菌S. acidiscabies ATCC 49003和S. turgidiscabies Car8对木栓质的适应性。S. scabies 87.22在木栓质培养基中生长更优；共培养时，S. acidiscabies产生抗生素oxanthromicin抑制其他菌株生长；暴露于木栓质后，S. scabies和S. acidiscabies分泌降解纤维素、半纤维素、脂肪酸和甘油衍生物的酶类。S. scabies 87.22在木栓质培养基中酯酶活性最高且纤维素酶基因表达显著诱导，而S. acidiscabies和S. turgidiscabies对trans-ferulic acid和p-coumaric acid利用能力弱，提示其降解木栓质芳香族组分能力不足。本研究表明S. scabies 87.22比新兴病原菌更适应马铃薯周皮降解，病原链霉菌互作机制的解析有助于改进疮痂病的生态防控策略。

Introduction

链霉菌（Streptomyces）是好氧革兰阳性丝状细菌（Actinobacteria门），多数为腐生菌，通过产生降解纤维素、半纤维素和木质素（lignin）等植物聚合物的胞外酶在土壤有机质分解中起关键作用。尽管多数链霉菌与植物互作中性或有益，部分种类可引起植物病害。全球分布的S. scabies是马铃薯普通疮痂病（potato common scab）的主要致病菌，病害特征为块茎表面形成木栓化疮痂（corky lesions）。除S. scabies外，新兴病原菌如S. acidiscabies和S. turgidiscabies也可引发类似症状。

侵染过程中，S. scabies接触块茎周皮（periderm）——抵御感染的第一道屏障。周皮细胞除初生细胞壁（纤维素 fibrils）外，还发育次生细胞壁，富含纤维素、半纤维素和木栓质。木栓质是一种脂质生物聚合物，由多脂肪族域（脂肪酸聚酯，通过酯键连接酯化阿魏酸）和多芳香族域（羟基肉桂酸衍生物聚合物，主要含p-香豆酸和trans-阿魏酸）组成。

木栓质是难降解聚合物，其降解主要归因于真菌，土壤细菌群落利用木栓质能力较弱。但S. scabies在含木栓质培养基中分泌多种脂代谢酶，且其基因组含suberinase编码基因sub1（属丝氨酸酯酶家族，又称cutinases，可水解cutin和木栓质脂肪族域的酯键）。S. scabies还能以木栓质芳香族主要组分trans-阿魏酸和p-香豆酸为碳源，此能力可能导致周皮降解并促进侵染。在木栓质存在下，S. scabies产生多种水解植物细胞壁多糖的酶，木栓质添加可诱导纤维素酶基因表达和分泌，部分纤维素酶为木栓质特异性诱导，表明S. scabies代谢适应此脂质聚合物。

尽管S. acidiscabies和S. turgidiscabies也是疮痂病致病菌，其降解马铃薯块茎周皮能力尚不明确。本研究比较了三种疮痂病致病菌（S. scabies 87.22、S. acidiscabies ATCC 49003和S. turgidiscabies Car8）在木栓质培养基中的生长能力，探讨了以木栓质为主要营养源时病原菌间互作，并分析了这些病原菌对木栓化组织或木栓质组分的酶响应。

Materials and methods

使用三种疮痂病致病菌：S. scabies 87.22、S. acidiscabies ATCC 49003和S. turgidiscabies Car8。细菌接种物制备于YME培养基（葡萄糖4 g L^?1，酵母提取物4 g L^?1，麦芽提取物10 g L^?1），30°C摇床培养48 h。收获菌体并重悬于生理盐水作为接种物。接种物添加至YME或对照培养基（CM，含L-天冬酰胺0.5 g L^?1、K₂HPO₄ 0.5 g L^?1、MgSO₄·7H₂O 0.2 g L^?1、FeSO₄·7H₂O 10 mg L^?1和 casein hydrolysate 0.05%），必要时CM添加trans-阿魏酸（60 μM）、p-香豆酸（50 μM）或0.1%木栓质（从马铃薯块茎纯化）。培养基pH调至7.0，30°C摇床培养。

细菌生长通过培养物DNA量间接评估，定期取样（1、3、5、7天），提取基因组DNA，通qRT-PCR扩增各菌株特有基因（sub1 for S. scabies 87.22、IQ63_12560 for S. acidiscabies ATCC 49003、fas1 for S. turgidiscabies Car8），基于标准曲线计算总基因组拷贝数（TGC）。

种间拮抗采用双层琼脂覆盖法：中心接种一种菌，覆盖含另一种菌的软YME琼脂，培养后观察抑制带。

S. acidiscabies ATCC 49003抗菌化合物鉴定：燕麦麸培养基培养3天，上清液酸化后 ethyl acetate 提取代谢物，TLC分离（硅胶GF板，氯仿:甲醇=9:1），软琼脂覆盖S. turgidiscabies Car8培养物确定活性Rf值，HPLC纯化活性组分，高分辨质谱（ESI-QqTOF）鉴定结构。

oxanthromicin对块茎影响：Russet Burbank品种块茎切片，滤纸碟添加oxanthromicin（10–250 μM）或溶剂对照，培养7天观察组织褐变。

oxanthromicin对细菌生长影响：滤纸碟添加5 μg oxanthromicin，置于含CaCO₃的YME琼脂平板，覆盖软琼脂含测试菌株。

蛋白质组分析：菌株在CM+木栓质培养7天，上清液浓缩后SDS-PAGE分离，胶内酶解，LC-MS/MS鉴定肽段（Scaffold软件，95%蛋白ID概率，2个独特肽段），功能注释基于UniProt、NCBI、KEGG和COG数据库，定位预测使用SignalP、TatFind或TatP，归一化光谱计数（NSpC）和归一化光谱丰度因子（NSAF）计算。

基因表达：S. scabies 87.22和S. acidiscabies ATCC 49003在CM或CM+木栓质培养5天，RNA提取并反转录为cDNA，qRT-PCR分析纤维素酶基因表达（gyrA为内参）。

酯酶活性测定：培养5天 supernatant，以p-nitrophenyl butyrate为底物，测定420 nm吸光值，计算酶活（μmol p-nitrophenol min^?1 mL^?1）。

肉桂酸利用能力：HPLC测定CM添加trans-阿魏酸或p-香豆酸培养物中残余底物量。

Results

Bacterial growth performance is altered by suberin as carbon source

在YME培养基中，三菌株单独培养时生长相似（S. scabies 87.22: 8.71–9.58 log TGC；S. acidiscabies ATCC 49003: 8.93–9.79 log TGC；S. turgidiscabies Car8: 8.30–9.38 log TGC）。三菌共培养时，S. acidiscabies和S. scabies生长略有下降（p≤0.01），而S. turgidiscabies生长显著受抑（6.99–6.44 log TGC，p<0.0001）。但S. turgidiscabies与S. scabies共培养时生长未受影响。

在CM+木栓质培养基中，S. scabies 87.22生长最佳（8.05–9.13 log TGC），S. acidiscabies ATCC 49003次之（7.51–8.43 log TGC），S. turgidiscabies Car8最差（6.10–6.67 log TGC）。三菌共培养时，S. scabies生长略降（7.89–8.80 log TGC，p<0.05），而S. acidiscabies（4.92–5.85 log TGC）和S. turgidiscabies（4.77–5.00 log TGC）生长显著下降（p<0.0001）。无S. acidiscabies时，S. turgidiscabies在CM+木栓质中生长仍差（4.87–5.35 log TGC，p≤0.0005），S. scabies生长稍优（p<0.02）。

Antagonism between the common scab-inducing species

双层琼脂法显示S. acidiscabies ATCC 49003抑制S. turgidiscabies Car8生长（清晰抑制带），2天时可见气生菌丝发育延迟带，8天时抑制带仍明显。S. acidiscabies对S. scabies 87.22抑制较弱，但2天时可见广泛气生菌丝抑制带，8天时菌丝灰白色（孢子形成延迟或抑制）。

S. acidiscabies ATCC 49003 antagonism relies on production of secondary metabolites

S. acidiscabies代谢物TLC分离显示两个抑制带（Rf~0.45–0.47可见光区，Rf~0.55–0.56 UV区）。HPLC纯化后活性组分高分辨质谱鉴定为oxanthromicin（m/z 653.1657）和oxanthroquinone（m/z 311.0560）。商业化oxanthromicin（5 μg）对S. turgidiscabies Car8和S. scabies 87.22均产生清晰抑制带，且对S. scabies气生菌丝发育有抑制。oxanthromicin（10–250 μM）处理马铃薯块茎切片未引起组织褐变。

Secretome analysis reveals adaptation to potato suberin

在CM+木栓质中，S. scabies 87.22分泌195种预测胞外蛋白，S. acidiscabies ATCC 49003分泌154种，S. turgidiscabies Car8仅分泌30种。功能分组显示S. scabies和S. acidiscabies的碳水化合物转运与代谢类蛋白比例高（29.7%和35.7% ACs），而S. turgidiscabies能量生产与转换类蛋白比例高（25.8% ACs）。

S. scabies 87.22分泌58种碳水化合物代谢相关蛋白，包括30种推测糖苷水解酶（其中7种为纤维素酶）；S. acidiscabies分泌55种相关蛋白，含26种糖苷水解酶（2种纤维素酶）；S. turgidiscabies仅分泌4种相关蛋白（1种糖苷酶）。

多种酶涉及L-阿拉伯糖代谢（S. scabies: 6种；S. acidiscabies: 3种）和木聚糖降解（S. scabies: 7种；S. acidiscabies: 4种）。

其他纤维素降解酶如β-甘露糖苷酶（S. scabies: C9YU29）、内切葡聚糖酶（S. acidiscabies: A0A0L0KQP3）等也被检测。

脂代谢相关蛋白：S. scabies 5种，S. acidiscabies 6种，S. turgidiscabies 1种。共通功能包括甘油三酯代谢酶（S. scabies: C9ZG71；S. acidiscabies: A0A0L0KIC3, A0A0L0KH73）、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶（S. scabies: C9Z5Z2；S. acidiscabies: A0A0L0KKU2, A0A0L0JN14）和胆固醇酯酶（S. scabies: C9Z6Y6；S. acidiscabies: A0A0L0K4E8）。S. turgidiscabies分泌一种乙酰-CoA C-转移酶（L7F7R8）。

Suberin induces cellulase gene expression in S. scabies 87.22

木栓质诱导S. scabies 87.22所有测试纤维素酶基因表达（3–130倍上调，p显著），而S. acidiscabies ATCC 49003两个纤维素酶基因未显著上调。S. turgidiscabies Car8未检测到纤维素酶分泌，故未测试。

Suberin induces esterase activity in common scab-inducing strains

S. scabies 87.22酯酶活性最高（22.57±3.64 μmol min^?1 mL^?1），S. acidiscabies ATCC 49003次之（13.43±2.76 μmol min^?1 mL^?1），S. turgidiscabies Car8最低（4.21±0.95 μmol min^?1 mL^?1），差异显著（p=0.026–0.005）。

S. acidiscabies and S. turgidiscabies exhibit poor degradation of cinnamic acids

S. acidiscabies ATCC 49003对p-香豆酸降解较强（24 h: 1.0%，48 h: 24.0%，72 h: 21.1%），对trans-阿魏酸降解弱（12 h: 8.1%，72 h: 8.3%）。S. turgidiscabies Car8对两种底物利用能力均弱（72 h降解~7.4–8.7%）。

Discussion

三种系统发育 distant 疮痂病致病菌比较显示S. scabies 87.22对马铃薯周皮适应能力最强，其在木栓质培养基中生长更优，分泌更多纤维素酶和酯酶，高效降解木栓质芳香族组分（trans-阿魏酸和p-香豆酸）。相反，S. acidiscabies和S. turgidiscabies利用木栓质能力较差。

蛋白质组分析提示S. turgidiscabies能量转换类蛋白比例高，反映其利用周皮组分能力差，而S. scabies和S. acidiscabies直接高效代谢周皮组分。

S. scabies和S. acidiscabies分泌多种碳水化合物活性酶（CAZymes），包括纤维素酶、阿拉伯糖和木聚糖代谢酶，支持其降解植物细胞壁能力。木栓质特异性诱导S. scabies纤维素酶基因表达，表明其适应宿主周皮降解的独特调控机制。

酯酶和脂酶在木栓质脂肪族域降解中起关键作用。S. scabies酯酶活性最高，可能得益于其cutinase Sub1（未在其他两菌检测）。甘油三酯代谢酶和甘油磷酸二酯酶参与疏水屏障突破和甘油利用（木栓质单体占20%）。S. turgidiscabies仅分泌脂肪酸β-氧化相关酶。

芳香族组分降解能力差异显著：S. scabies可快速降解trans-阿魏酸和p-香豆酸（15 h >93%），而S. acidiscabies和S. turgidiscabies72 h降解<25%。此能力可能增强S. scabies在宿主定植中的适应性，并抵御植物防御产生的毒性羟基肉桂酸。

种间拮抗由S. acidiscabies产生的抗生素oxanthromicin介导，其对S. turgidiscabies抑制最强，对S. scabies主要抑制气生菌丝发育。oxanthromicin属聚酮类，可能通过影响Ras GTPases抑制细菌生长，但非植物致病因子（不诱导块茎防御反应）。抗生素生产可能在遗传相近竞争者存在时诱导，帮助生产者侵占生态位。

Conclusion

S. scabies 87.22比新兴病原菌更适应马铃薯周皮降解，体现于生长优势、高酶活性和芳香族降解能力。此适应性可能增强其在土壤中的生存竞争力（即使无马铃薯作物）。种间拮抗（oxanthromicin介导）的揭示有助于设计基于竞争性的疮痂病生物防治策略。

Acknowledgements

MK获埃及高教部和加拿大Centre SèVE博士奖学金支持。