BEVA2.0：模块化金门载体系统的扩展及其在细菌基因工程中的应用与优化

本刊郑重推荐《BEVA2.0：模块化金门兼容载体的模块化组装及其在基因工程中的扩展应用》。该研究系统性扩展了BEVA（细菌表达载体库）工具包，新增11种功能模块（包括克隆位点变体、抗生素抗性（如aadA、nptII）、复制起点（如RSF1010、p15A）及辅助元件（如sacB、FRT/attP位点）），显著提升了载体构建的灵活性和宿主适应性。通过验证多种广宿主载体和基因组编辑工具质粒，本研究为合成生物学和微生物工程提供了高效、标准化的解决方案，并实现了与CIDAR MoClo系统的兼容，进一步推动了高通量遗传操作技术的发展。

　　

BEVA2.0：模块化金门兼容载体的扩展与工程应用

引言

金门DNA组装技术自诞生以来，彻底改变了多片段DNA线性有序组装的能力，推动了合成生物学领域的快速发展。模块化克隆（MoClo）系统通过标准化部件的分层组装，成为研究人员构建复杂遗传工具的重要平台。早期MoClo系统主要应用于植物工程，例如通过农杆菌（Agrobacterium）介导的tDNA整合进行植物改造。随着时间推移，该系统逐渐扩展到微生物领域，例如酵母和细菌。CIDAR MoClo库即为细菌设计的标准化部件库，包含多种启动子、核糖体结合位点、编码序列和终止子等部件。然而，随着金门克隆技术的广泛应用，研究人员对具有更广宿主适用性和功能多样性的金门兼容载体的需求日益增长。为此，细菌表达载体库（BEVA）应运而生，该系统通过模块化部件库实现金门克隆载体的灵活组装。

材料与方法

新BEVA模块的设计基于现有克隆载体的功能单元，并通过合成生物学手段消除内部BsaI、BpiI（BbsI）和BsmBI（Esp3I）酶切位点。模块合成采用pTwist Amp High Copy或pTwist Chlor High Copy骨架，或通过BsaI克隆至Cm^R pGGAselect载体中。部分模块通过PCR扩增并克隆至pJet1.2载体进行原型构建，后续为消除骨架中的BsaI位点，将其重新克隆至pGGAselect或重新合成。

金门克隆位点模块通过改造pOGG004的Level 1克隆位点获得。pNDGG021和pNDGG022排除了克隆位点3′端的T0终止子，pNDGG022进一步将5′端BsmBI（Esp3I）融合位点改为CAGA，从而允许绕过包含rrnB T1终止子的末端连接器/终止子模块，实现与Position 4模块3′融合位点的直接连接。

抗生素抗性模块两侧添加5′ BsmBI（Esp3I）-GCAA和3′ ACTA-BsmBI（Esp3I）位点，以便作为Position 2模块整合至BEVA系统。卡那霉素/新霉素抗性基因nptII（pNDGG001）来自克隆载体pTH1937，包含nptII开放阅读框及上游241 bp区域。壮观霉素抗性基因aadA（pNDGG002）基于pHP45Ωspec中间体合成，包含aadA开放阅读框及上下游区域。

复制起点和转移模块两侧添加5′ BsmBI（Esp3I）-ACTA和3′ TTAC-BsmBI（Esp3I）位点，作为Position 3模块使用。p15A（pNDGG006）和pMB1（pNDGG007）的序列分别源自pTH1937和pUCP30T。广宿主复制起点RSF1010（pNDGG005）通过PCR从pRSF-LtetO-GFP扩增，并与pOGG026的oriT区域通过BsaI金门克隆组合而成。

辅助模块包括蔗糖反选择基因sacB（pNDGG008）、FRT位点（pNDGG009）、attP ?C31整合酶靶位点（pNDGG010）及I-SceI位点（pQGG001）。这些模块两侧添加5′ BsmBI（Esp3I）-TTAC和3′ CAGA-BsmBI（Esp3I）位点，作为Position 4模块使用。

CIDAR终止子（T2m、T12m、T15m）通过改造3′融合位点以匹配BEVA Level 1克隆载体，并克隆至pOGG006作为Level 0部件使用。

金门克隆反应使用BsmBI-v2、Esp3I或BsaI-HF-v2限制酶及T4 DNA连接酶，在特定温度循环条件下进行。反应产物转化至化学感受态大肠杆菌DH5α，并通过抗生素和X-gal筛选阳性克隆。载体构建通过限制性酶切和全长质粒测序验证。

遗传操作使用所列细菌菌株，培养基为LB或LBmc（含MgCl₂和CaCl₂），抗生素浓度根据菌株调整。接合转移采用三亲本杂交，利用辅助菌株MT616。表型筛选通过平板复制和牙签点种进行。

荧光测量通过流式细胞术和酶标仪进行。细胞在LB培养基中培养至对数期，重悬于PBS后稀释并上机检测。荧光参数根据荧光蛋白特性设置。

结果与讨论

BEVA通过11种新模块的加入显著扩展了其功能性和适用性。新模块包括广宿主复制起点RSF1010、抗生素抗性基因aadA和nptII、窄宿主复制起点p15A和pMB1、位点特异性重组位点FRT和attP、反选择标记sacB和I-SceI等。这些模块的加入使BEVA能够构建更多样化的复制型质粒，并支持通过同源重组或位点特异性重组进行基因组操作。

广宿主范围金门表达载体套装结合了四种抗生素抗性模块（aadA、nptII、tetAR、acc3）和三种广宿主复制起点（RK2、pBBR1、RSF1010），采用标准BEVA架构（Level 1克隆位点、par辅助簇、末端连接器ELT4）。载体稳定性实验表明，par模块对pBBR1质粒的稳定性影响不大，但显著提高了RSF1010质粒的稳定性。Level 1克隆验证显示，携带sfGFP的RK2、pBBR1和RSF1010载体均能在大肠杆菌中表达荧光，但RSF1010载体存在非荧光亚群。

利用sacB模块构建的pBBR1质粒（pNDGG070）可通过蔗糖反选择有效去除，实验证明其在Sinorhizobium meliloti中能够实现高效质粒消除。

同源重组载体采用p15A复制起点，构建了包含I-SceI位点的多种版本载体（如pQGG004），用于双同源重组删除实验。在S. meliloti中删除phaZ基因的效率约为14%，但存在较大波动，建议使用多个单重组子进行下游优化。

Flp/FRT删除方法通过位点特异性重组实现大片段删除或整合。新构建的整合型载体采用pMB1复制起点和改造的Level 1克隆位点（如pNDGG021），并引入FRT位点模块（pNDGG009）以便在克隆同源区域时添加FRT位点。这些载体在S. meliloti中成功用于idhA删除，效率与传统克隆载体相当。

BEVA与CIDAR系统的兼容性通过改造CIDAR终止子的3′融合位点实现。将CIDAR终止子（T2m、T12m、T15m）重新克隆为DF部件，使其与BEVA载体的CGCT融合位点匹配。利用CIDAR部件（启动子J23106、RBS BCS12）和荧光蛋白基因（sfCFP、sfGFP、sfYFP、mScarlet-I）在BEVA载体中构建了组成型表达载体，并在S. meliloti中验证了其功能。

结论

BEVA2.0的扩展显著提升了其在细菌遗传工程和合成生物学中的应用价值。新模块的加入不仅扩大了载体的宿主范围和功能多样性，还提供了高效的基因组操作工具。与CIDAR系统的兼容性进一步丰富了部件选择，推动了标准化和高通量遗传操作的发展。BEVA2.0已成为细菌遗传学和合成生物学研究中的重要社区资源，支持多种应用场景，包括菌株条形码、CRISPR碱基编辑及微生物工程等。