肉鸡盲肠微生物组与抗菌饲养方案及性别差异的关联研究及其对抗菌素耐药性(AMR)的启示

本综述系统探讨了不同抗菌饲养方案(AFPs)和性别对肉鸡盲肠微生物组的深远影响。研究通过培养依赖与独立方法(如16S rRNA和宏基因组测序)揭示了常规(CON)、无医学重要抗生素(RWMIA)及无抗生素(RWA)方案下微生物群落结构、耐药基因(ARGs)、毒力基因(VGs)和代谢功能的差异。特别发现性别显著调节特定ARGs(如tufAB)和VGs(如tssB)的丰度，且RWA方案下雌性鸡Enterococcus和Eimeria tenella增殖显著。这些发现为通过精准饲养策略调控肠道微生物组、减少AMR传播及改善家禽健康提供了关键科学依据。

　　

引言

在禽类生产中，抗菌剂使用(AMU)与改善生长性能、成本效益、饲料转化率、疾病预防和通过调节微生物群维护肠道健康相关。然而，过度的AMU导致了细菌中抗菌素耐药性(AMR)的上升。细菌通过水平基因转移(包括结合质粒和转座子等移动遗传元件)交换遗传信息，包括抗菌素耐药性基因(ARGs)。头孢噻呋是一种仅用于动物的β-内酰胺类第三代头孢菌素抗生素，通常注射到一日龄雏鸡或蛋中以预防由大肠杆菌引起的卵黄囊感染，这可能导致选择出头孢噻呋耐药的大肠杆菌。涉及bla_CMY-2基因的耐药机制可能诱导其他细菌对其他人用重要药物(如头孢曲松和头孢霉素)产生耐药性。据报道，鸡肉产品中的头孢噻呋耐药海德堡沙门氏菌与人类感染头孢噻呋耐药海德堡沙门氏菌的事件相关。因此，AMR的社会经济和公共卫生问题导致了对AMU的限制，并采用了无医学重要抗生素(RWMIA)或完全无抗生素(RWA)以及有机禽类生产。

全球范围内对 livestock 中抗生素的使用进行了监管。允许或限制抗生素的标准并非全球统一，因此可能因国家而异。有机生产旨在与环境协调，依赖生态维持和有机物质的使用。有机生产的严格要求重新带来了健康和管理问题，例如鸟类在自由放牧牧场接触环境病原体。由于抗生素具有多种有益效果且成本效益高，寻找能够模仿或改进抗生素的替代产品应成为研究重点。RWA下的生产必须依赖抗生素替代品，如益生菌、益生元、饲料中酶、植物化学物质、有机酸、精油和疫苗。阿维拉霉素(avilamycin)是一种对人类医学重要性较低的抗菌剂，以及包括盐霉素(salinomycin)、尼卡巴嗪(nicarbazin)和那拉星(narasin)在内的抗球虫药被用于肉鸡饲料中以改善禽类性能，推测是通过改善肠道健康实现的。先前的研究发现这些药剂的使用与抗菌剂耐药性大肠杆菌的流行没有明确关联。

禽类肠道微生物群在维持整体健康、免疫系统发育、能量稳态和抵御病原体方面起着关键作用。环境条件、营养(饲料、水等)和宿主因素(品种、性别、年龄、疾病等)影响禽类肠道微生物群组成。一项在放牧肉鸡中进行的纵向研究发现回肠样本中有14个细菌门，所有采样时间点的主要类群为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和软壁菌门(Tenericutes)。这些作者和其他人报告称肠道微生物群组成随禽类年龄而变化。最近，鸟枪法宏基因组测序证明了饮食和球虫病疫苗接种对肉鸡盲肠微生物群、病毒组、耐药组和代谢途径的影响。调查特定抗菌饲养中性别对肉鸡肠道微生物组影响的研究有限，并且对可能与性激素效应相关的性别相关微生物组和AMR差异知之甚少。在人类中，性别似乎对疾病AMR有 distinct 影响，并且已报道男性和女性尿路致病性大肠杆菌分离株之间存在差异。在本研究中，我们应用培养依赖和独立(下一代测序)方法来表征与常用抗菌饲养程序(AFP)和鸟类性别相关的肉鸡盲肠微生物组，以确定盲肠微生物组的差异。

材料与方法

禽类与饲养

本研究中的所有实验程序均经圭尔夫大学动物护理和使用委员会批准，并遵循加拿大动物护理委员会描述的指南。研究的详细设计和日粮配方已由Bean-Hodgins等人描述。简而言之，2304只一日龄雄性(M, n=1152)和雌性(F, n=1152)罗斯-708肉鸡雏鸡，接种了马立克氏病和支气管炎疫苗，根据初始体重分配到48个地面栏舍(48只/栏；8栏/性别组)。每个栏舍面积为4.3平方米，配备乳头饮水器，并允许直接接触桶式喂食器，地板上铺有新鲜刨花作为垫料。

研究设计

日粮配方已由Bean-Hodgins等人描述。每个性别组被分配到三种AFP之一(8栏/AFP)：常规(CON，基础日粮，开食期添加110 ppm甲基二水杨酸杆菌肽，生长期和育肥期添加55 ppm杆菌肽)；无医学重要抗生素(RWMIA，基础日粮，开食期和生长期添加20 ppm阿维拉霉素)和无抗生素(RWA)。RWA饲养的肉鸡在孵化场接受了球虫病疫苗(Coccivac-B)接种。每种AFP在不同生长阶段饲料中使用的完整抗菌剂剂量和补充剂见表1。开食料(D0至D14)、生长料(D15至D28)和育肥料(D29至D41)根据育种者指南为罗斯-708配制以满足营养需求。

样品收集与细菌学

从每个性别组中，随机选择两只鸡/栏(8栏/AFP)并在28日龄(D28)和41日龄(D41)处死以收集其盲肠(每个程序总共16只鸡)。收集的盲肠转移到无菌Whirl-Pak塑料袋中，并在处理前于-80°C保存。从D28(n=92)和D41(n=92)每个栏舍的192个盲肠样品中获得总平板计数的大肠杆菌及其头孢噻呋耐药菌株。大肠杆菌在补充有大肠杆菌/大肠菌群选择性补充剂的Chromocult Coliform Agar (CCA, Merck KGaA)上进行计数。使用补充有4 μg/mL头孢噻呋的CCA来计数头孢噻呋耐药的大肠杆菌。在37°C孵育24小时后，计数菌落并以每克盲肠内容物的CFU(CFU/g)表示。

DNA分离与16S rRNA基因测序

收集所有三种程序下192只鸡的盲肠样品(D28, n=96; D41 n=96)(CON, n=64; RWMIA, n=64; RWA, n=64)，使用QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Venlo, Netherlands)提取其基因组DNA，用于Illumina MiSeq进行16S rRNA测序。分别使用1.0%琼脂糖凝胶电泳和Qubit Fluorometer (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)检测试剂盒(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)测定DNA质量和浓度。

16S rRNA基因测序文库的制备根据Illumina 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation Guide进行。简而言之，使用包含Illumina overhang adapter序列的引物(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和Bakt_805R (5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)扩增16S基因的V3–V4高变区。将KAPA HiFi HotStart ReadyMix (VWR)与12.5 ng DNA和每种引物200 nmol/L混合进行扩增，并使用AMPure XP beads (Beckman Coulter)纯化PCR产物。使用Nextera XT Index kit (Illumina)通过PCR将包含8碱基对指数的测序接头添加到3′和5′末端，再次使用Ampure XP beads纯化。使用Quant-iT PicoGreen double-stranded DNA assay kit (Invitrogen)对扩增子进行定量，将等摩尔比的混合池与5%等摩尔PhiX DNA (Illumina)结合，使用MiSeq 600-cycle v3 kit (Illumina)在MiSeq测序系统上进行测序。

使用微生物生态学定量洞察(QIIME version 2.0)分析盲肠16S rRNA序列。计算每个分类学水平上细菌丰度的相对频率。计算了α多样性(组内)指标和基于未加权和加权UniFrac度量的β多样性(组间)距离矩阵，用于主坐标分析(PCoA)。

鸟枪法宏基因组测序与分析

为了进行微生物组分析，收集了D41时RWMIA (n=12)和RWA (n=12)程序下的部分盲肠样品子集，使用QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen)提取DNA，用于如前所述的宏基因组测序。使用FastQC (v0.11.8)和MultiQC (v1.6)检查每个样品和整个数据集的序列质量。使用Trimmomatic (v 0.38)去除接头，切除Phred分数低于30的前导和尾随碱基。使用滑动窗口修剪当平均碱基质量降至Phred分数15以下的读数，并移除长度小于36个碱基的读数。全宏基因组鸟枪法测序和质量控制步骤如前所述进行。雄性盲肠DNA在NextSeq 550仪器上使用High Output v2.5 300-cycle kit进行测序，每个样品产生78.14 ± 22.55百万条读数。使用Kraken2分析微生物群，AMR++ (http://megares.meglab.org/amrplusplus)分析抗菌素耐药性基因(ARGs)，Short Read Sequence Typing-2 (SRST2, http://www.mgc.ac.cn/VFs)和毒力因子数据库分析毒力基因(VGs)，HUMAnN 3.0分析代谢功能。使用R的vegan (v 2.5)包计算样品丰富度和均匀度的α多样性(Chao, Shannon, and Simpson)指数和(Bray–Curtis相异性)。通过多变量统计和相似性分析(ANOSIM)评估微生物多样性与性别和/或AFP之间的关联。使用R包vegan v2.5以Bray–Curtis相异性作为样品间距离度量进行组间样品变异或β多样性分析。对于所有进行的统计分析，P值≤0.05被认为是显著的。

统计分析

对Log₁₀转换后的总大肠杆菌和头孢噻呋耐药大肠杆菌以及细菌类群的相对丰度进行统计分析，根据随机完全区组设计，使用Statistical Analysis System version 9.4 (SAS Institute Inc. 2016)的General Linear Mixed Model程序。抗生素饲养程序、鸡只年龄(D28和D41)和鸡只性别(雌性和雄性)用作变异来源，栏舍作为实验单位。每当F值显著时，使用最小显著性差异(LSD)来分离均值。在16S rRNA序列分析中，对α多样性(Kruskal–Wallis)和β多样性(PERMANOVA)使用配对统计检验。使用微生物组组成分析(ANCOM)进行门、属和物种水平的差异丰度(DA)分析。使用方差分析(ANOVA)和随机检验分析ARGs丰度的差异。使用Cochran–Mantel–Haenszel统计量分析基因与AFP或性别之间的关联。使用Spearman等级相关分析盲肠细菌属与ARGs之间的相关性。P值≤0.05用于声明显著效应。

结果

大肠杆菌计数

在D28肉鸡中，观察到RWMIA (6.82)和RWA (6.06)之间大肠杆菌丰度存在显著差异(P=0.0403)(表S1)。然而，在D41肉鸡中未观察到显著的性别或APF效应。在D28和D41时，未观察到天数(年龄)或性别对头孢噻呋耐药大肠杆菌数量的显著影响。未观察到性别和AFP之间对大肠杆菌及其头孢噻呋耐药分离株的显著交互作用(表S1)。

来自16S rRNA测序的盲肠细菌群落

Alpha-多样性

在D28时，对于α多样性指数Chao1、Shannon和Simpson，未观察到性别、AFP及其交互作用之间的显著差异。CON-F的Pielou均匀度高于RWA-F；RWMIA-F高于RWA-F和RWA-M (P<0.05)(图S1)。观察到饮食-性别组合(处理)对Strong优势指数的显著影响(图S1)。在D41时，对于盲肠微生物群的α多样性指数，组间未观察到显著差异。

Beta-多样性

根据Bray–Curtis相异性和Jaccard距离分析，对于盲肠微生物群的β多样性指数，观察到AFP和采样天数(肉鸡年龄)之间的差异性(表S2和图S2)(q<0.05)。在CON下饲养的雌性肉鸡与在RWA下的雌性和雄性肉鸡聚类不同，而CON-F与RWMIA-M不同(q<0.05)。如表S2所示，根据Bray–Curti相异性、Jaccard和加权UniFrac距离，在CON-M与RWMIA和RWA下的雌雄肉鸡之间以及RWMIA和RWA下的雄性和雌性肉鸡之间观察到差异性(q<0.05)。在D41肉鸡中，观察到AFP和性别之间的差异性(q<0.05)，但RWA中的性别之间除外(q>0.05)。

分类学组成

在D28和D41日龄肉鸡中检测到的门包括厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、软壁菌门(Tenericutes)和互养菌门(Synergistetes)。根据ANCOM，在D28和D41肉鸡中蓝藻门(Cyanobacteria)的丰度存在显著差异，以及在D41比较AFP和性别时，放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)的丰度存在显著差异。受AFP、性别或其交互作用(AFPs×性别)显著影响(P<0.05)的细菌属见表2。在D28日龄肉鸡的盲肠中，双歧杆菌属(Bifidobacterium)、蓝藻门(Cyanobacteria)(RWA>RWMIA和CON)、节丝状菌属(Arthromitus)(RWMIA>RWA和CON)、粪球菌属(Coprococcus)(RWMIA>CON)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)和真杆菌属(Eubacterium)(RWA>CON)的丰度受AFP影响(P<0.05)。粪球菌属(Coprococcus)、毛螺菌科(Mogibacteriaceae)和丹毒丝菌科(Erysipelotrichaeceae)在雄性中的丰度高于雌性。如表2所示，注意到AFP和性别之间的交互作用对肠球菌属(Enterococcus)(RWA-F>所有其他AFP-性别组)和软壁菌门(Tenericutes)(CON-M>RWMIA-F和-M)的丰度有影响。在D41时，观察到APF对Eggerthella(CON>RWA)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、真杆菌属(Eubacterium)(RWA>RWMIA和CON)、Dorea属、乳杆菌属(Lactobacillus)(CON和RWMIA>RWA)、节丝状菌属(Arthromitus)、梭菌纲SHA-98(Clostridia SHA-98)(CON>RWMIA和RWA)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)(RWMIA>CON)和厌氧支原体属(Anaeroplasma)(CON和RWA>RWMIA)丰度的影响。与雌性肉鸡相比，雄性肉鸡的乳杆菌属(Lactobacillus)、Anaerostipes属、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)更为丰富。注意到APF和性别之间的交互作用对Rikenellaceae科(CON-M>CON-F和RWA-M)和巨单胞菌属(Megamonas)(RWMIA-M>CON-M)的丰度有影响。肠球菌属(Enterococcus)在D28表现出显著的AFP×性别效应，RWA-F携带的肠球菌属丰度显著高于其他AFP-性别组(P<0.05)(图1)。

鸟枪法宏基因组测序

测序统计

如上所述，使用在D41收集的来自RWMIA (n=6)和RWA (n=6)的盲肠样品子集制备高质量的盲肠DNA样品，用于鸟枪法宏基因组测序和分析，以更深入地了解微生物群组成(包括病毒和古菌)以及耐药组(ARGs)、病毒组(毒力基因)和代谢基因谱。每个样品平均产生78.14±22.55百万条读数。

Kraken2微生物群分析

病毒：Shannon α多样性指数显示，比较RWMIA-F与RWMIA-M (P=0.0366)、RWA-M (P=0.0157)和RWA-F (P=0.0069)时，盲肠病毒存在差异(图2)。对于Simpson和物种计数α多样性指标，未观察到APF、性别或APF与性别交互作用的显著影响。

古菌和真核生物：对于古菌的α多样性，未观察到APF或性别之间的显著差异。然而，真核生物在APF和性别组合之间对于Shannon (P<0.05)和Simpson (P<0.05) α多样性指数表现出差异。Tukey诚实显著差异检验显示，RWA-F的Shannon和Simpson多样性指数低于RWMIA-M、RWMIA-F和RWA-M(图3)。根据相似性分析(ANOSIM)，对于古菌和真核生物的β多样性，未观察到APF、性别或其交互作用的影响。

艾美耳球虫：正如预期，柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是肉鸡盲肠中鉴定出的最丰富的艾美耳球虫属物种，其中RWA的丰度最高(P<0.05)，与RWMIA相比(图4)。由于数据变异性高(P>0.05)，未注意到性别对柔嫩艾美耳球虫丰度的显著影响。

细菌：对于α多样性(Shannon, Simpson, and Chao)，未观察到AFP或性别的显著主效应。然而，配对t检验表明AFP×性别组合在物种计数上存在差异(P=0.05)(图5)。β多样性分析显示RWA和RWMIA以及AFP-性别组之间存在差异性(P≤0.05)(图6)。在RWA和RWA程序下饲养的肉鸡盲肠宏基因组中鉴定出属于不同属的629种细菌物种。最丰富的门是厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)，其中以厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门为主(图S3)。Alistipes属(在RWMIA-M和RWA-F中更丰富)、Lachnoclostridium属(在RWA-F中较少)和肠球菌属(Enterococcus)(在RWA中更丰富，与QIME结果一致)在组间显示出差异(P=0.03)。

抗菌剂耐药基因

通过AMR++鉴定出约248个基因(ARGs)赋予对40种不同抗菌剂的耐药性(图7)。在RWMIA-M、RWMIA-F、RWA-M和RWA-F组中分别平均检测到216、174、188和205个ARGs。观察到性别对A16S(由于16S rRNA甲基化导致的氨基糖苷类耐药)、lnuC(林可酰胺类)、rrsA(抗菌肽)和tufAB(延长因子Tu抑制剂)耐药基因丰度的影响(P<0.05)。具体来说，这些ARGs在雄性中的丰度高于雌性。其他10个ARGs(aph3-dprime、ermB、lnuB、lsa、msrD、lsaE、sat2、sodB、tet32、tetL)的丰度受到肠道管理程序(AFPs)的影响，并且注意到耐药组按肠道管理程序存在明显的聚类(P<0.05)(图8)。与RWA相比，在RWMIA下饲养的肉鸡中，aph3-dprime(氨基糖苷类)、ermB(红霉素)、sat2(链丝菌素)和tet32(四环素)基因更为丰富，而与RWMIA相比，在RWA肉鸡中，ARGs msrD(大环内酯类)、sodB(超氧化物)、lnuB(林可酰胺类)、lsa/lsaE(截短侧耳素、林可酰胺类和链阳性菌素类)和tetL(四环素)更为丰富(P<0.05)。

对分类的ARGs分析显示，与雌性相比，延长因子Tu抑制剂和氨基香豆素耐药基因在雄性中更丰富(P<0.05)。还观察到性别对四环素类药物以及药物和杀菌剂耐药性的影响(P<0.05)。此外，与RWA相比，RWMIA肉鸡中核苷(P=0.0163)和汞(P=0.0222)耐药基因显著更丰富。与RWMIA相比，RWA中发现了最丰富的利福平耐药基因(P=0.0212)。注意到AFPs对赋予对铜、磷霉素、脂肽、多金属、镍、碲、药物和杀菌剂耐药性的基因的影响(P<0.05)。

ARGs与细菌属之间的相关性

使用来自Kraken2分析的分类学谱，发现细菌属与ARGs之间存在正相关和负相关(图9)。在RWMIA饲养的禽类中，11个(巨单胞菌属(Megamonas)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、Thomasclavelia属、Faecalibacterium属、Marvinbryantia属、Enterocloster属、Faecalitalea属、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、埃希氏菌属(Escherichia)和Wansuia属)和3个(Gordonibacter属、Faecalicatena属和脱硫弧菌属(Desulfovibrio))细菌属分别与至少一个ARG类别呈正相关和负相关(P<0.01)(图9A)。伯克霍尔德菌属(Burkholderia)和埃希氏菌属(Escherichia)与ARG类别(乙酸酯、铜、多杀菌剂、多金属、过氧化物和锌耐药性)共享最多的(6个)正相关。在RWA饲养的禽类中，分别有21个和12个细菌属与至少一个ARG类别呈正相关和负相关(P<0.01)(图9B)。与其他细菌属相比，埃希氏菌属(Escherichia)表现出与ARGs最高数量的正相关，总共与14个ARG类别存在正相关，包括乙酸酯、酸、β-内酰胺类、金属(铜、镍、钠和锌)、磷霉素和过氧化物耐药性。

SRST2病毒组分析

在所有样品中检测到超过306个VGs，编码粘附素、鞭毛、铁获取、保护素和毒素，在RWMIA-M、RWMIA-F、RWA-M和RWA-F中分别平均发现183、271、177和200个VGs，表明组间VGs数量存在差异(P=0.05)(图10)。最丰富的VGs包括那些编码TTSS效应子传递(134)、肠杆菌素(72)和 aerobactin 合成与摄取系统(56)以及粘附因子curli纤维(36)和ECP(34)的VGs。β多样性分析揭示了四个AFP组之间的差异性(P=0.03)。

粘附：未注意到AFP或性别之间的显著差异。然而，大约六个常见于大肠杆菌和其他变形菌门中的基因(csgC、eaeH、fimE、fimF、stgA和tar)往往(0.1>P>0.05)在雌性禽类中比雄性更丰富。

鞭毛：对于鞭毛相关基因的丰度，未观察到AFP或性别之间的差异。然而，flgC和flgN往往(0.1>P>0.05)在雌性中比雄性更普遍。

铁利用：血红素摄取chuY基因在RWMIA饲养的禽类中比在RWA饲养的禽类中更丰富(P<0.05)，而eivJ1、iroB和iroC基因往往(0.1>P>0.05)在RWMIA中比RWA更丰富。

分泌系统：VI型分泌系统基因tssB在雌性禽类中比雄性更丰富(P<0.05)，而aec17和cheR基因往往在雌性禽类中更普遍。大约七个分泌系统相关基因(aec24、gspC、gspD、gspE、gspF、gspJ和tssJ)在RWMIA饲养的禽类中显示出更高的丰度趋势(0.1>P>0.05)。

未观察到AFP或性别对α多样性指数的显著影响。Bray–Curtis相异性分析揭示了性别-AFP组之间的差异性(P=0.031)，AFP倾向于(P=0.06)单独聚类。

HUMAnN 3代谢功能分析

使用MetaCyc数据库，在D41肉鸡的盲肠中检测到约3354种特定代谢途径，分为35种途径类型，包括活化/失活/互变、生物合成、降解、能量代谢、聚糖途径、大分子修饰、代谢簇和超级途径(图11)。ANOSIM分析揭示了AFP之间(P=0.007)以及AFP-性别组之间(P=0.048)的差异性。总体而言，在RWA下饲养的肉鸡中发现了最高丰度的代谢途径基因。这些途径包括酒精降解、氨基酸降解、氨基酸生物合成、芳香化合物生物合成、超级途径和TCA变体(P<0.05)。

代谢途径与细菌属之间的相关性

使用Spearman等级相关，细菌属与代谢途径之间的显著相关性见图12。在RWMIA禽类中，七个属(Anaerofilum、Anaerotruncus、Clostridiales、Escherichia、Lachnoclostridium、Lactobacillus和Massiliomicrobiota)与至少一条代谢途径呈正相关(P<0.05)。在RWA中，19个细菌属与至少一条代谢途径呈正相关(P<0.05)。七个不同分类学水平的细菌属(Alistipes、Enterococcus、Erysipelatoclostridium、Firmicutes、Klebsiella、Phascolartobacterium和