基于MALDI-TOF质谱技术的加拿大赤霉病病原菌快速鉴定与物种多样性研究

本刊推荐：本研究系统构建了加拿大赤霉病相关镰刀菌物种的MALDI-TOF MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）肽质量指纹图谱参考库，通过对820株小麦源和74株燕麦/大麦源菌株的验证分析，证明该方法与DNA检测（HT-qPCR）具有95%和86%的一致性。研究表明MALDI-TOF MS可实现镰刀菌物种复合体（species complex）水平的精准鉴定，为农业病原菌监测提供了快速（3天培养）、低成本的高通量技术方案，对赤霉病（FHB）防控和粮食安全具有重要意义。

　　

Abstract

镰刀菌头枯病（Fusarium head blight, FHB）是严重危害谷物生产的真菌病害，可由多种镰刀菌（Fusarium）物种引起。本研究评估了基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行物种鉴定的能力。该方法为每个样本生成独特的肽质量指纹图谱（PMF），可与参考库进行匹配。研究首先建立了加拿大境内镰刀菌物种的PMF参考库，随后使用两个验证组（820株小麦来源和74株燕麦/大麦来源真菌分离株）通过物种特异性DNA标记的高通量定量PCR（HT-qPCR）确认样本物种身份。第一验证组以禾谷镰刀菌（F. graminearum）为主，MALDI-TOF MS与DNA鉴定结果一致性达95%；第二验证组以梨孢镰刀菌（F. poae）为主，两种方法一致性为86%。结果表明MALDI-TOF MS生物分型技术可灵敏地将镰刀菌鉴定至物种复合体水平，部分菌株可鉴定至物种水平。

Introduction

FHB（又称“墓碑病”或“赤霉病”）是谷物的毁灭性真菌病害，可侵染大麦、金丝雀种子、玉米、饲草、燕麦、黑麦、小黑麦和小麦。虽然禾谷镰刀菌是小麦FHB最常见病原菌，但多种其他镰刀菌物种也与该病害及霉菌毒素产生相关，包括藤仓镰刀菌复合体（Fusarium fujikuroi species complex）、接骨木镰刀菌复合体（Fusarium sambucinum species complex）、三线镰刀菌复合体（Fusarium tricinctum species complex）和 incarnatum-equiseti 复合体（Fusarium incarnatum-equiseti species complex）的成员。

病害初期表现为开花中期花器组织上的浅褐色病斑，随后病斑扩大融合，最终覆盖整个花器并呈现漂白色。病原菌会破坏淀粉颗粒、储存蛋白和细胞壁，同时产生对人体和动物健康有害的霉菌毒素，包括单端孢霉烯族毒素（如T-2、HT-2、雪腐镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物3-ADON、15-ADON、NX毒素）以及玉米赤霉烯酮（ZEN）。

传统形态学鉴定准确性有限且操作挑战大，DNA检测虽可自动化但成本较高且需专业设备。MALDI-TOF MS通过分析真菌组织释放的蛋白质，生成特征性PMF图谱，与参考库中的主谱图谱（MSP）进行生物统计学比对实现鉴定。该技术在临床微生物学中应用广泛，但在植物病原真菌鉴定方面的研究相对有限。

本研究旨在建立针对加拿大FHB相关镰刀菌物种的MALDI-TOF MS参考库，并评估该方法在谷物生产环境中的鉴定能力。通过测试不同真菌组织（分生孢子与菌丝体）制备策略，并使用2021–2023年度加拿大多地田间分离株组成验证组，以DNA检测方法确认未知菌株身份，最终为加拿大谷物生产中的重要镰刀菌物种提供新的鉴定与表征方法。

Materials and methods

Fungal material

菌株分为参考组（70株镰刀菌，代表加拿大常见9个物种）和两个验证组（第一组820株来自小麦，第二组74株来自燕麦和大麦）。参考组菌株通过HT-qPCR确认身份，验证组菌株同时采用MALDI-TOF MS和HT-qPCR进行物种鉴定。

Culturing conditions

参考组菌株在25°C马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上黑暗培养3天收获菌丝体；16株代表菌株在羧甲基纤维素（CMC）液体培养基中振荡培养5–7天生产分生孢子。验证组菌株从加拿大谷物委员会收获样本计划提供的FHB损伤籽粒中分离，在含200 μg/mL壮观霉素的PDA上培养后收获菌丝体。

MALDI-TOF MS biotyping

菌丝体采用甲酸-乙醇提取法制备样本：菌丝体经水洗、乙醇沉淀、甲酸和乙腈提取后，取1 μL上清液点靶，覆盖HCCA基质溶液干燥后上机检测。分生孢子采用直接转移法：孢子悬液调整至1×10⁶ spores/mL后点靶。每个菌株生成20个PMF图谱（4生物学重复×5技术重复）创建MSP，所有数据整合至Bruker丝状真菌库v.4.1.100.6。验证组菌株制备3个技术重复进行鉴定。

DNA testing

保留培养后的麦粒进行DNA提取，采用SmartChip HT-qPCR系统和物种/毒素基因型特异性引物 panel 进行检测，确认菌株身份。

Results

MALDI-TOF MS can differentiate some Fusarium species

成功建立包含70个菌丝体MSP和16个分生孢子MSP的镰刀菌参考库。PMF图谱显示不同组织和物种间存在明显差异。MSP聚类分析表明，物种边界虽不明确，但进化关系模式清晰：三线镰刀菌复合体成员（F. avenaceum 和 F. acuminatum）形成独立分支，接骨木镰刀菌复合体成员（F. graminearum、F. cerealis、F. culmorum、F. poae、F. sporotrichioides）也聚集在一起，其中F. poae 和 F. sporotrichioides 相似度更高。藤仓镰刀菌复合体（F. proliferatum）与尖孢镰刀菌复合体（F. oxysporum）未能区分。

使用菌丝体进行鉴定时，样本可正确归属至物种复合体，但常错误鉴定至复合体内其他物种（如F. acuminatum 被误判为 F. avenaceum）。分生孢子鉴定准确性达100%，但孢子生产更耗时费力。两种组织类型的PMF图谱差异显著，且均无法实现菌株水平或毒素基因型（如15-ADON、3-ADON）的区分。

MALDI-TOF MS identified Fusarium species from field samples of Canadian wheat, oat, and barley from 2021 to 2023

验证组一中MALDI-TOF MS与HT-qPCR物种鉴定一致性达95%。主要鉴定物种为禾谷镰刀菌（90%），其次为燕麦镰刀菌（F. avenaceum，6%）、梨孢镰刀菌（3%）和拟枝孢镰刀菌（F. sporotrichioides，1%）。2021–2023年间所有省份均以禾谷镰刀菌为主，但2021年（干旱年）和2023年物种多样性较高，2022年多样性较低。验证组二以梨孢镰刀菌为主，两种方法一致性为86%。

Discussion

FHB对加拿大谷物生产造成重大经济损失（如2016年 epidemic 导致约10亿加元损失）。病原菌鉴定对病害管理至关重要。DNA检测虽准确性高但成本昂贵且需多DNA条形码测序；PCR方法无法覆盖所有镰刀菌物种。MALDI-TOF MS具有快速、低成本优势，但现有库对加拿大FHB相关物种代表性不足。

本研究通过扩充参考库提高了鉴定能力，但菌丝体鉴定仅能达到物种复合体水平，与既往研究一致。菌丝年龄和菌落直径不影响鉴定结果，3天培养即可满足检测需求，增强了方法灵活性。分生孢子鉴定准确性更高但制备困难。两种方法差异可能源于培养污染或混合感染，DNA检测可独立靶向特定物种标志物。

2021年干旱导致西部加拿大FHB发生率和严重度降低，2022年物种多样性减少，2023年恢复。持续监测对检测病原种群变化至关重要。

Conclusion

MALDI-TOF MS可用于镰刀菌鉴定，但菌丝体检测在物种复合体内存在局限。分生孢子鉴定可能更准确但挑战更大。该方法无法区分菌株或毒素基因型，不受菌丝年龄影响（测试7天内），具有低成本优势，可补充形态学和DNA检测方法，为FHB监测提供重要技术支持。