猪链球菌9型对高温及副猪格拉瑟氏菌共培养的应答：生物膜表型转变与致病潜力研究

本综述深入探讨了猪链球菌（S. suis）血清9型（SS9）在发热温度（41°C）及与副猪格拉瑟氏菌（G. parasuis）共培养条件下的表型适应机制。研究通过表型分析、生物膜定量（结晶紫染色）及酶解实验（Proteinase K/DNase I/α-amylase），揭示高温显著增强临床株SS9C的生物膜形成能力，且其胞外聚合物（EPS）组成呈现菌株特异性差异。该发现为理解宿主发热环境下S. suis从共生向致病态转换提供了关键实验依据，对猪呼吸道疾病综合征（PRDC）的防控策略具有重要启示。

　　

引言

猪链球菌（Streptococcus suis）是猪上呼吸道早期定植的共生菌，也可作为机会性病原体引发严重疾病，其中血清2型（SS2）是全球猪死亡率的重要诱因。近年来，血清9型（SS9）在西班牙、荷兰、德国、中国及加拿大等地的疾病案例中检出率显著上升，但其致病机制尚未明确。副猪格拉瑟氏菌（Glaesserella parasuis）同为上呼吸道共生菌，与S. suis共同参与猪呼吸道疾病综合征（PRDC）的发病过程。宿主因原发性感染（如猪流感病毒、猪肺炎支原体）出现发热（40–42°C）时，可能促使共生菌向致病态转换。本研究通过分析临床SS9菌株（SS9C）在高温（41°C）及与G. parasuis共培养条件下的生长特性与生物膜表型，探讨环境及微生物互作对其致病潜力的影响。

材料与方法

菌株与培养条件

研究选用临床分离的S. suis血清9型（SS9C）、健康来源血清9型（SS9H）及临床血清2型（SS2C），以及G. parasuis血清3型（GP3）与5型（GP5）。所有菌株于含20%甘油的BHI肉汤中-80°C保存，培养使用巧克力琼脂（G. parasuis）或BHI琼脂（S. suis），均在5% CO₂环境下进行。

单菌与共培养生长曲线

通过监测OD₆₀₀及平板菌落计数（CFU/mL）评估12小时内单菌（3.0 × 10⁶ CFU/mL）与1:1共培养（1.5 × 10⁶ CFU/mL每种菌）的生长动态，并计算竞争指数（CI）与相对增加比率（RIR）。

温度效应分析

将菌株划线培养于BHI琼脂，在37°C与41°C下培养72小时，观察菌落形态变化，并使用体视显微镜记录表型特征。

生物膜定量与酶解实验

通过结晶紫染色法量化24、48、72小时生物膜形成量，并采用Proteinase K（500 μg/mL）、DNase I（1 U/μL）及α-amylase（2.5 U/μL）处理72小时生物膜，分析胞外聚合物（EPS）中蛋白质、eDNA及多糖的贡献。同步进行浮游菌与附着菌的CFU计数。

统计分析

使用SAS 9.4与RStudio进行三因素ANOVA及t检验，显著性阈值设为α < 0.05。

结果

液体共培养中的菌间互作

与单菌培养相比，共培养中GP3在10–12小时与SS9C或SS2C共培养时菌量显著下降（p< 0.05），但与GP5共培养未观察到显著互作效应。

温度对菌落表型的影响

SS9C与SS2C在41°C培养时更早出现菌落形态不规则化（粗糙边缘、楔形扇形及表面凸起），而SS9H在不同温度下均保持光滑菌落形态。

生物膜酶解特性

Proteinase K与α-amylase处理在37°C与41°C下均显著降低所有菌株的生物膜量（p< 0.005），表明蛋白质与多糖是S. suis生物膜的关键结构成分。DNase I在37°C下对任何菌株无显著影响，但在41°C下可显著减少SS2C与SS9H的生物膜量（p< 0.0001），而对SS9C无影响，提示SS9C在高温下可能通过其他机制维持生物膜完整性。

SS9C在高温下的生物膜形成

结晶紫染色显示，SS9C在41°C下生物膜形成量显著高于37°C（p< 0.0001），且高于SS9H与SS2C。共培养（SS9C+GP3或GP5）进一步增强了这一效应。然而，CFU计数表明生物膜量的增加并未伴随附着菌或浮游菌数量的上升，提示生物膜基质合成增强而非菌体增殖。

共培养对菌量的影响

在41°C共培养72小时后，SS9C与GP5共培养时浮游菌量显著下降（p= 0.0107），SS9C与GP3共培养时GP3浮游菌量亦减少（p= 0.0003）。附着菌量在各条件下保持稳定。

讨论

本研究首次系统比较了S. suis血清9型在宿主发热温度及与G. parasuis共培养条件下的表型响应。临床菌株（SS9C、SS2C）在41°C下呈现的菌落粗糙化可能与荚膜丢失或表面黏附素调整有关，此类表型变异常见于病原体适应环境压力的策略，并可增强毒力与生物膜形成。SS9C在高温下生物膜形成能力的显著提升，与其EPS中蛋白质与多糖的核心作用一致，但eDNA的贡献呈现菌株特异性（SS9C抗DNase I消化），表明不同菌株可能采用差异化机制维持生物膜结构。

共培养并未如假设引发浮游菌释放增加，反而在高温下导致部分菌量下降，可能与菌间竞争或代谢状态改变有关。这一发现与既往关于S. suis与G. parasuis互作增强毒力的报道形成对比，提示菌株特异性及环境条件（如培养时间、温度）对互作效应具有重要调节作用。

结论

高温（41°C）可显著增强S. suis血清9型临床分离株的生物膜形成能力，且其EPS组成与结构响应具有菌株特异性。尽管与G. parasuis共培养未直接促进浮游态转换，但温度驱动的表型适应可能增强S. suis在宿主发热期间的定植持久性与致病潜力。后续研究需结合转录组与蛋白组学，深入解析其分子调控机制。