基于扩增子测序的微生物组分析揭示储粮害虫新型内共生菌关联及其生态意义

本研究采用16S rRNA基因扩增子测序技术，对35种储粮害虫实验室种群进行微生物组分析，成功鉴定出包括Wolbachia、Sodalis、Rickettsia等经典内共生菌的单重/混合感染，并发现多个非典型γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）的新型潜在共生关联。该方法无需预先设定宿主-共生菌配对假设，为快速筛查昆虫内共生系统提供了高效技术路径，对开发基于微生物组的害虫防控策略具有重要价值。

　　

Abstract

许多节肢动物（包括 economically important pests of stored grains）携带细胞内细菌共生体，这些共生体对宿主形态、应激耐受性和繁殖成功率具有深远影响。本研究通过基于扩增子测序的微生物组分析方法，快速筛查了35个实验室昆虫种群，有效揭示了细胞内细菌共生体的单重和混合感染情况，以及优势共生菌的存在与否。该方法无需预先设定宿主-共生菌配对假设，能够快速识别新型关联。研究强调了内共生菌的普遍性，指出了值得进一步研究的意外配对（如非经典内共生菌属的优势细菌类群），并揭示了同一宿主昆虫物种不同种群在内共生细菌存在和身份上的差异。

Introduction

节肢动物细胞内细菌共生现象广泛存在，据估算约40%的陆生节肢动物物种可能感染Wolbachia这一常见共生菌谱系。细胞内共生菌可通过影响生殖相容性、通过次级代谢产物提供保护功能以及改变宿主形态发育等方式调控宿主适应性。传统培养方法存在 laborious 和 cultivation bias 的局限，且许多内共生菌因基因组严重退化而无法独立培养。DNA-based methods 极大促进了该领域发展，但特异性PCR检测需预先设定可能存在的宿主-共生菌配对。基于扩增子测序的微生物组分析靶向高度保守区域，可无偏好性地揭示微生物组成，此前已成功应用于khapra beetles、tsetse flies等昆虫的共生菌研究。本研究旨在将该技术应用于加拿大农业与农业食品部Morden研发中心保存的昆虫种群内共生菌感染状态鉴定。

Materials and methods

研究对象主要为储粮害虫物种，包括一种寄生蜂（Anisopteromalus calandrae）。取5-20只整虫经 bead beating 破碎后，使用PureLink Microbiome Purification Kit进行DNA提取。除35个昆虫种群样本外，设置两个阴性对照和一个 mock community reference sample（ATCC MSA-3002）。针对16S rRNA基因V4高变区，使用515F/806R引物（带可变长度spacers和Nextera Indexing kit兼容 overhangs）进行扩增。测序在曼尼托巴大学使用MiSeq仪器完成（v2 2×250 paired end）。序列数据处理采用Dada2 workflow，分类鉴定基于Silva v.138数据库。Wolbachia超群划分通过自定义参考序列集（含A-F, H-P, S超群46条序列）实现。

Results and discussion

从整虫DNA提取物中成功获得细菌扩增子，不同昆虫种群微生物组多样性差异显著。部分样本中单个amplicon sequence variant占主导（如Attagenus unicolor中Wolbachia占比99%），另存在双重优势模式（如Gibbium aequinoctiale中Wolbachia与Rickettsia共存）。该方法可有效检测常见共生菌（如Wolbachia、Sodalis）感染状态，且能提示新型关联：例如Ahasverus advena中62%序列属于无法精确分类至属水平的γ-变形菌纲变异体；Acanthoscelides obtecte中优势变异体同时匹配Enterobacter和Klebsiella数据库记录，需通过附加基因座测序进一步验证。

同一宿主不同种群间存在共生菌组成差异：在Sitophilus属中观察到Sodalis或Wolbachia单独感染、Wolbachia+Sodalis或Rickettsia+Sodalis混合感染等多种模式。特别值得注意的是，在Tribolium种群中发现Izhakiella（占 reads 40%）的高丰度存在，这凸显了微生物组分析在产生新假说方面的价值。

本研究共鉴定出71个Wolbachia序列变异体，其中2个属超群A，44个属超群B，4个属超群F（主要存在于Gibbium aequinoctiale）。阴性对照中检测到的Wolbachia序列（720条和82条）表明存在样本间交叉污染，需对新型关联进行验证。

由于使用整虫样本，该方法无法区分细胞内共生菌与肠道/外皮微生物。建议后续研究通过组织分离（如单独提取消化道DNA）或使用阻断引物（类似植物微生物组研究中阻断叶绿体DNA扩增的策略）针对性研究特定微生物类群。

需注意实验室种群在简化饲料条件下长期饲养可能导致微生物组与野外种群存在差异，且扩增子测序仅提供相对丰度信息，而绝对定量对理解生态影响至关重要。

Conclusion

微生物组分析为快速筛查昆虫内共生菌提供了高效方法。随着已知关联的不断扩展，该技术将继续揭示新颖的昆虫-细菌共生关系。从应用角度而言，这些关联认知可能为开发害虫防控新策略提供基础，例如通过调控共生菌干预害虫危害性和疾病传播能力。