鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sediminicola DSM 18106T结瘤能力的重新评估：对α-根瘤菌分类界限的澄清

本刊推荐：本研究通过基因组重测序与植物结瘤实验，系统推翻了Sphingomonas sediminicola DSM 18106T能够诱导豌豆根瘤形成的结论。研究证实该菌株缺乏结瘤（nod）和固氮（nif）基因，且无法形成有效根瘤，进一步明确了α-根瘤菌（alpha-rhizobia）的分类学界限仅限于Hyphomicrobiales目。该成果对根瘤菌-豆科植物共生机制的认知具有重要修正意义。

　　

引言

根瘤菌（rhizobia）是一类能够与豆科植物建立共生固氮关系的土壤细菌，根据分类学特征可分为α-根瘤菌（alpha-rhizobia，属于Alphaproteobacteria类）和β-根瘤菌（beta-rhizobia，属于Betaproteobacteria类）。目前所有已确认的α-根瘤菌均属于Hyphomicrobiales目。然而，近年Mazoyon等人提出Sphingomonas sediminicola DSM 18106^T（属于Sphingomonadales目）携带一个约520 kb的质粒，编码结瘤和固氮基因，并能诱导豌豆（Pisum sativum）形成根瘤。这一发现若成立，将显著扩展α-根瘤菌的 taxonomic 分布范围。本研究旨在通过基因组重测序和植物实验验证这一结论。

材料与方法

研究使用S. sediminicola DSM 18106^T（购自DSMZ菌种保藏中心）和Rhizobium johnstonii 3841^T（作为阳性对照）。细菌培养采用?强度R2A培养基（针对S. sediminicola）和TY培养基（针对R. johnstonii）。通过16S rRNA基因测序验证菌株身份，并采用Oxford Nanopore长读长测序技术对S. sediminicola进行全基因组测序。基因组组装使用Flye和medaka抛光，注释采用NCBI PGAP流程。此外，重新分析了Mazoyon等人发布的Illumina测序数据（SRA登录号：SRR18460303–SRR18460307），使用Unicycler和SPAdes进行组装，并通过BLAST比对搜索结瘤基因（nodA, nodB, nodC）、固氮基因（nifH, nifD, nifK）和III型分泌系统基因（sctQ）。

植物实验选用两个商业豌豆品种，在无菌条件下进行幼苗培育，采用Leonard Assembly系统种植。分别接种S. sediminicola（约2×10⁶ CFU）、R. johnstonii（1×10⁸ CFU）及未接种对照，培养28天后观察结瘤情况、植株表型，并测定茎和根的干重。对疑似结节进行表面灭菌、破碎培养和16S rRNA测序以鉴定内生菌。

结果与讨论

S. sediminicola DSM 18106^T基因组中未发现质粒及结瘤基因

对Mazoyon等人发布的Illumina数据重新组装后，获得的三条纯净基因组contig总长度约为2.755–2.761 Mb，与S. sediminicola KACC 15039^T的染色体大小（~2.757 Mb）一致，但未发现~520 kb质粒。BLASTp分析显示，这些组装中不存在NodA/B/C、NifH/D/K或SctQ的同源蛋白。直接对原始Illumina reads进行BLASTn搜索也未检测到nodA、nodB或nodC序列。进一步使用SPAdes对混合数据集（含S. sediminicola、S. daechungense和Paenibacillus污染序列）进行组装时，虽能部分匹配Mazoyon报道的463个质粒基因（最高93%），但关键结瘤和固氮基因仍缺失。这表明所谓“共生质粒”可能是由于测序污染和组装错误产生的 artefact。

重测序结果支持无质粒结论

通过ONT测序获得的S. sediminicola DSM 18106^T基因组为一条2,756,582 bp的环状染色体，完整度99.12%，污染率为0%。注释结果再次确认无质粒存在，且缺乏所有结瘤、固氮及T3SS相关基因。与Illumina重组装基因组的平均核苷酸一致性（ANI）高于99.98%，且共线性分析显示所有contig均映射到染色体区域。对Mazoyon报道的463个质粒基因的BLASTn搜索显示，仅227个（49%）与染色体序列高度匹配，且这些基因成簇分布，进一步支持“质粒”实为染色体片段与污染序列的错误组装。

S. sediminicola无法诱导豌豆结瘤

植物实验显示，接种R. johnstonii的豌豆植株生长旺盛、叶片深绿、根瘤丰富且呈粉红色（表明固氮功能正常）；而接种S. sediminicola或未接种的植株则呈现生长迟缓、叶片黄化，且无任何根瘤形成。茎和根干重测量结果进一步证实S. sediminicola处理组与对照组无显著差异。在重复实验中，虽在S. sediminicola接种组发现少量根瘤，但从中分离出的细菌经16S rRNA测序鉴定均为Rhizobium属（与R. johnstonii 3841^T序列100%一致），而非S. sediminicola。这表明结瘤由实验操作中污染的根瘤菌引起，而非S. sediminicola本身能力所致。

结论

综合基因组学与实验证据，S. sediminicola DSM 18106^T不具备结瘤或固氮的遗传基础，也无法诱导豌豆形成根瘤。该结果否定了Mazoyon等人关于Sphingomonadales目存在α-根瘤菌的结论， reaffirms 所有已知α-根瘤菌均分类学局限于Hyphomicrobiales目。研究强调了严格控制实验污染、多重验证基因组组装的重要性，并对根瘤菌-宿主共生机制的演化边界提供了明确约束。