miR-582-3p靶向PTPRCAP通过Wnt/β-catenin通路调控肺腺癌恶性进展的机制研究

本研究深入探讨了microRNA-582-3p（miR-582-3p）通过靶向蛋白酪氨酸磷酸酶受体C关联蛋白（PTPRCAP）调控Wnt/β-catenin信号通路在肺腺癌（LUAD）进展中的分子机制。实验证实miR-582-3p在LUAD中高表达且与不良预后相关，其通过直接抑制肿瘤抑制因子PTPRCAP激活Wnt通路，促进肿瘤增殖、迁移和侵袭。该发现为LUAD的靶向治疗提供了新的理论依据和潜在生物标志物。

　　

引言

肺腺癌（LUAD）是全球癌症相关死亡的主要原因，占所有肺癌病例的约40%。由于缺乏特异性早期症状，大多数患者确诊时已处于晚期，常伴有局部侵袭和远处转移，导致5年总生存率低于20%。现代生物医学技术的进步和多学科方法的整合为LUAD开辟了新的治疗途径，但仍需深入了解其分子发病机制以确定有效的治疗靶点。

蛋白酪氨酸磷酸酶受体C关联蛋白（PTPRCAP）属于PTPR家族，直接与PTPRC相互作用以稳定其表达。PTPRC编码CD45，是72个生存磷酸酶中18个PTP基因之一。越来越多的证据表明，PTPRCAP下调促进结直肠癌中的免疫逃逸，并与肝细胞癌的不良临床病理特征和预后不良相关。此外，最近的单细胞RNA-seq研究显示，PTPRCAP在碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）肺炎患者的NK和B细胞中上调，表明其作为免疫状态生物标志物的潜力。虽然PTPRC已被报道通过Wnt信号通路调节非小细胞肺癌（NSCLC）中的上皮-间质转化（EMT），但其结合伙伴PTPRCAP在LUAD中的确切作用尚待探索。

MicroRNAs（miRNAs）是一类小的非编码RNA，通过结合靶mRNA中的互补序列在转录后调控基因表达。多种miRNA的异常表达在NSCLC中已有记录，并涉及肿瘤发生和进展。其中，miR-582-3p已被证明通过抑制TGF-β通路抑制前列腺癌骨转移，控制肝细胞癌中的增殖和侵袭，并在LUAD中被lncRNA PRKCQ-AS1海绵化，从而调控下游基因表达。使用TargetScan进行的计算机分析预测，miR-582-3p在PTPRCAP的3′-UTR内含有潜在的结合位点，表明存在新的miR-582-3p/PTPRCAP调控轴。

Wnt/β-catenin信号级联是驱动肿瘤进展的关键通路。该通路的异常激活已在乳腺癌、胃癌、宫颈癌和肺癌中描述。具体而言，miR-1246通过靶向GSK-3β和激活Wnt/β-catenin信号促进NSCLC转移。最近的证据进一步表明，miR-582-3p可以增强Wnt/β-catenin通路活性。因此，我们假设miR-582-3p可能通过直接靶向PTPRCAP并同时激活Wnt/β-catenin通路促进LUAD进展。

基于上述背景，本研究整合临床标本、功能测定和动物模型与生物信息学和分子生物学，阐明miR-582-3p如何靶向PTPRCAP并通过Wnt/β-catenin通路驱动LUAD进展，从而提供新的分子见解。

材料与方法

数据来源：从TCGA数据库获取33种癌症类型的miRNA-seq数据，包括521个原发性肺腺癌（LUAD）肿瘤样本和46个配对的癌旁正常肺组织。原始测序数据使用BCGSC miRNA分析流程处理，并标准化为每百万映射读取的读取数（RPM）。所有分析在R（版本4.2.1）中进行，无需对数转换或批次校正以保持数据完整性。从TCGA-LUAD数据集中检索相应的临床数据用于整合分析。

组织和细胞：从承德医学院附属医院胸外科接受手术切除的肺腺癌患者中获取45对肿瘤和癌旁正常组织标本。所有标本在手术切除后立即在液氮中速冻，并存储在-80°C直至后续实验。其中女性27例，男性18例；28例年龄≥60岁，17例年龄<60岁，平均年龄（62.29±7.45）岁；23例处于I期，22例处于II期；3例低分化，39例中分化，3例高分化；6例有淋巴转移。纳入标准：1. 经病理学确认的肺腺癌患者；2. 取样前未进行抗肿瘤治疗（放疗、化疗、免疫治疗或抗肿瘤中成药治疗）；3. 从未患有任何其他恶性肿瘤。排除标准：1. 数据不完整和/或其他恶性肿瘤患者；2. 术前接受过放疗和化疗等其他抗肿瘤治疗的患者。人肺腺癌细胞A549、H1299和正常肺上皮细胞BEAS-2B来源于承德医学院附属医院中心实验室。研究经医院伦理委员会批准，并获得患者知情同意。

试剂和仪器：血清和基础培养基购自普诺赛生命技术有限公司；miR-582-3p模拟物（miR-582-3p mimics）和阴性对照（mimics NC）购自安徽金标生物技术有限公司；PTPRCAP过表达质粒购自南京晶普赛尔生物技术有限公司；Lipofectamine 3000转染试剂、PTPRCAP引物和GAPDH引物购自美国Invitrogen；双荧光素酶报告基因检测系统购自美国Promega公司；miR-582-3p引物和U6引物购自天根生化技术（北京）有限公司；反转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）试剂盒和CCK-8试剂盒购自思科生物技术有限公司；Matrigel购自美国Biozellen公司；PTPRCAP抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，中国，GAPDH抗体购自武汉赛维尔生物技术有限公司；β-catenin抗体购自华安生物技术有限公司；GSK3β和p-GSK3β抗体购自奕碧薇生物技术有限公司；山羊抗兔免疫球蛋白G二抗购自艾博泰克生物技术有限公司。

细胞培养、转染和分组：BEAS-2B、A549和H1299细胞分别在DMEM、RPMI-1640和F12K培养基中复苏和传代，补充10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素，随后在恒温培养箱中培养。A549和H1299细胞接种于6孔板，当达到约80%融合时，使用Lipofectamine 3000转染试剂进行转染。细胞分为以下组别：miR-582-3p组、miR-NC组、OE组、Vector组、miR-582-3p + OE组和miR-582-3p + Vector组。具体而言，miR-582-3p组和miR-NC组分别转染最终浓度为100 nM的miR-582-3p模拟物和模拟物NC；OE组和Vector组分别转染每孔2500 ng的PTPRCAP过表达质粒和相应对照质粒；miR-582-3p + OE组和miR-582-3p + Vector组共转染相应试剂。转染后，细胞首先在基础培养基中培养24小时，随后更换为含10% FBS的完全培养基再培养24小时，然后进行后续实验。

RNA提取、反转录和实时荧光定量聚合酶链反应：组织用低温组织匀浆器研磨，使用Trizol试剂提取组织和细胞的总RNA，通过反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。RT-qPCR系统的配置和反应条件严格按照荧光定量试剂盒的说明进行。相对量使用2^-ΔΔct方法计算。PTPRCAP正向引物序列5’-CAGGACACACAGACTATGACCACG-3’；反向引物序列5’-GTCACTGTCTCTGGCTTCCTCA-3’。GAPDH正向引物序列5’-CGACCACTTTGACAAGCTCA-3’，反向引物序列5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’。miR-582-3p正向引物序列5’-UCAGUGACAGUAGUUUGUCAAG-3’；反向引物序列5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。U6正向引物序列5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；反向引物序列5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

免疫组织化学：组织切片脱蜡，通过微波抗原修复修复，并在3%过氧化氢封闭液中孵育15分钟。切片冷却后，用10%山羊血清封闭；滴加一抗（PTPRCAP 1:500）在4°C过夜；第二天，一抗复温1小时；滴加二抗并在37°C孵育30分钟；DBA显色，苏木精复染，脱水透明，胶封，显微镜观察结果。阳性细胞百分比评分为0-4（0为0%-5%，1为5%-24%，2为25%-49%，3为50%-74%，4为75%-100%）。染色强度评分为0~3（0为阴性染色，1为弱染色，2为中度染色，3为强染色）。免疫反应评分（IRS）计算为IRS = PP*SI，其中PP代表阳性细胞百分比评分，SI是染色强度水平。IRS ≤ 2分类为低表达，> 2为高表达。

双荧光素酶基因报告实验：使用Target Scan识别miR-582-3p和PTPRCAP之间的潜在相互作用以及预测的结合位点。为实验验证此相互作用，我们构建了包含推定的miR-582-3p结合序列的野生型（WT-PTPRCAP）和突变型（MUT-PTPRCAP）荧光素酶报告载体。A549和H1299细胞接种于6孔板，并共转染miR-582-3p模拟物或模拟物NC以及相应的报告载体（WT-PTPRCAP或MUT-PTPRCAP）。转染后，细胞在基础培养基中培养24小时，随后更换为完全培养基（10% FBS）再培养24小时。使用双荧光素酶报告基因检测系统测量荧光素酶活性，并通过计算萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶发光比率确定相对活性。该实验证实了miR-582-3p对PTPRCAP表达的调控作用。

Western blot实验：从每个实验组提取总蛋白并定量。蛋白样品通过SDS-PAGE（160 V恒定电压）分离，并转移至甲醇激活的PVDF膜（400 mA恒定电流）。转移后，膜在室温下用5%脱脂牛奶TBST封闭2小时，随后与一抗：抗PTPRCAP（1:1000）、抗GAPDH（1:4000）、抗β-catenin（1:1000）、抗GSK3β（1:2000）和抗p-GSK3β（1:4000）在4°C过夜孵育。第二天，膜复温1小时，用TBST洗涤（3×10分钟），并与HRP偶联二抗（1:10000）孵育1小时。最终洗涤后（3×10分钟TBST），使用C300成像系统可视化蛋白条带。使用ImageJ软件通过计算靶蛋白与GAPDH信号比率量化条带强度。

CCK-8检测细胞增殖活性：细胞悬液计数并接种于96孔板，每组6个复孔，每孔加入100 μl含2500个细胞的细胞悬液。细胞培养0小时、24小时、48小时、72小时后，每孔加入10 μl CCK-8试剂。继续在37°C培养箱中孵育2小时后，用酶标仪测量450 nm波长处的吸光度值（OD值）。

划痕愈合实验：A549细胞和H1299细胞接种于6孔板，每组3个复孔。当细胞密度达到约80%时进行转染。细胞培养至孔底覆盖后，用10 μl移液器吸头尖端垂直划痕孔底。用PBS洗去漂浮细胞，并加入基础培养基培养。分别在0小时和24小时下在倒置显微镜下拍摄划痕区域。

Transwell细胞迁移和侵袭实验：迁移实验：转染后48小时，细胞（3×10⁴/孔）在1% FBS培养基中接种于上室，而下室包含700 μl的20% FBS培养基。孵育24小时后，用棉签移除未迁移细胞。通过膜的细胞用甲醇固定，1%结晶紫染色，并在倒置显微镜下定量。侵袭实验：上室预先涂覆Matrigel（Corning）。细胞（5×10⁴/孔）如迁移实验所述接种，后续步骤相同。

统计分析：数据使用Graphpad Prism 10.0软件进行统计分析和绘图。服从正态分布的计量数据以均数±标准差表示；两组间数据比较使用t检验，多组间数据比较使用单因素方差分析或双因素方差分析；不服从正态分布的数据使用Wilcoxon秩和检验。计数数据以[例数（%）]表示，使用配对四格表χ2检验。P < 0.05为差异有统计学意义。（P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001, P < 0.001）。

结果

肺腺癌中miR-582-3p和PTPRCAP的表达及其靶向关系

我们从TCGA数据库下载数据并分析了miR-582-3p在泛癌中的表达。结果显示，miR-582-3p在多种肿瘤中显著高表达，包括肺腺癌。对TCGA-LUAD数据集的进一步调查显示，miR-582-3p表达在肺腺癌组织中显著高于癌旁组织（n = 521, P = 0.018, 95%CI: 0.080-0.873）。这一发现在体外进一步验证。qRT-PCR分析表明，与正常人支气管上皮细胞BEAS-2B相比，miR-582-3p表达在肺腺癌细胞系A549和H1299中显著上调，分别显示3倍（n = 5, 95%CI: 1.678-2.329, P < 0.0001）和2.6倍（n = 5, 95%CI: 0.997-2.273, P < 0.001）增加。TargetScan生物信息学预测表明，PTPRCAP基因含有与miR-582-3p互补的结合位点，这表明PTPRCAP可能是miR-582-3p的直接靶基因。我们进行了靶向验证，在双荧光素酶报告实验中，转染miR-582-3p模拟物和WT-PTPRCAP的实验组细胞与转染miR-NC和WT-PTPRCAP的对照组相比，相对荧光素酶活性显著降低；转染miR-582-3p模拟物和MUT-PTPRCAP的实验组细胞与转染miR-NC和MUT-PTPRCAP的对照组相比，相对荧光素酶活性无统计学显著差异，表明miR-582-3p与PTPRCAP确实存在靶向结合（n = 3, 95%CI:0.189-0.321, P < 0.0001）。通过qRT-PCR检测18例肺腺癌和癌旁组织以及正常肺上皮BEAS-2B细胞和肺腺癌A549和H1299细胞中PTPRCAP mRNA的相对表达水平。结果表明，与癌旁正常组织相比，PTPRCAP表达在肿瘤组织中显著下调（P = 0.001）。值得注意的是，A549和H1299细胞中的PTPRCAP mRNA水平分别相对于BEAS-2B细胞降低70%（n = 4, P < 0.0001）和50%（n = 4, P < 0.001）。可见miR-582-3p可以靶向结合PTPRCAP在LUAD中发挥作用。

miR-582-3p与临床病理特征的关系

在本研究中，我们使用根据BCGSC流程处理的TCGA-LUAD（癌症基因组图谱-肺腺癌）数据集中的miRNA-seq数据分析了miR-582-3p表达与临床病理特征的关系。我们的结果表明，miR-582-3p表达与T分期、N分期、病理分期和总生存期（OS）显著相关，但与M分期、性别、年龄、原发肿瘤位置或吸烟状况无关。具体而言，与T1疾病患者相比，T2、T3和T4分期患者的miR-582-3p表达显著升高（P = 0.005, 95%CI:0.118-0.626）。类似地，N2和N3分期肿瘤的miR-582-3p水平显著高于N0和N1分期病例（P = 0.006, 95%CI:0.144-0.882）。此外，III期和IV期患者的miR-582-3p表达相对于I期和II期个体显著增加（P < 0.001, 95%CI:0.296-0.937）。死亡患者比存活患者表现出更高的miR-582-3p表达（P < 0.001, 95%CI:0.194-0.735）。值得注意的是，高表达组中T2-T4期疾病比例更大（36.1% vs. 30.5%, P = 0.010），N2-N3淋巴结转移率更高（9.3% vs. 5.7%, P = 0.032），III-IV期肿瘤患病率增加（13.0% vs. 8.0%, P = 0.006）。重要的是，miR-582-3p表达升高的患者表现出显著更差的死亡率（20.9% vs. 14.8%, P = 0.004）。调整TNM分期和其他混杂因素的Cox回归分析证实，高miR-582-3p表达仍然是一个独立的预后预测因子（HR = 1.440, 95% CI: 1.018-2.037, P = 0.039）。风险比与T2-T4期（HR = 1.629, P = 0.030）和III-IV期疾病（HR = 2.376, P = 0.014）相当。有趣的是，虽然N/M分期在单变量分析中显示出预后意义，但在多变量模型中失去了统计学显著性。这些发现表明，miR-582-3p可能通过增强局部侵袭和淋巴结转移影响肺腺癌进展。总之，我们的结果不仅将miR-582-3p确立为一个新的预后生物标志物，而且揭示了其在关键肿瘤进展通路中的生物学相关性，为开发miR-582-3p靶向精准诊断和治疗策略提供了理论依据。

PTPRCAP与临床病理特征的关系及PTPRCAP蛋白表达

通过Western blot检测正常肺上皮细胞系BEAS-2B和肺腺癌细胞系A549和H1299中PTPRCAP蛋白的表达，并通过免疫组织化学测定45例肺腺癌患者癌组织和癌旁组织中PTPRCAP蛋白的表达，分析PTPRCAP蛋白表达水平与临床特征的关系。Western blot结果表明，与正常肺上皮BEAS-2B细胞相比，肺腺癌细胞系A549和H1299中PTPRCAP蛋白表达下调，分别降低20%（n = 3, P = 0.015）和30%（n = 3, P = 0.01）。临床样本的免疫组织化学分析显示，癌组织中PTPRCAP蛋白阳性表达率（22.22%, 10/45）显著低于癌旁非癌组织（93.33%, 42/45），癌组IRS评分显著低于正常组（中位数 = 1.8 (IQR 1.2–2.0) vs. 中位数 = 3.6 (IQR 2.8-4.0)；Mann-Whitney U = 101, P < 0.0001）。不同TNM分期和不同组织分化程度患者中PTPRCAP阳性表达率有统计学显著差异，但不同年龄、性别和淋巴结转移患者中PTPRCAP阳性表达率无统计学显著差异。以上结果表明PTPRCAP可能在肺腺癌的发生发展中起到一定的抑制作用。

miR-582-3p、PTPRCAP转染效率验证

分别用Lipofectamine 3000转染试剂将miR-582-3p模拟物、模拟物NC和PTPRCAP的对照质粒转染入A549细胞和H1299细胞，分为miR-582-3p组、miR-NC组、OE组和Vector组。通过RT-qPCR和Western blot验证各组的转染效率。转染PTPRCAP过表达质粒和对照质粒后，荧光显微镜下初步显示转染效率（n = 4, P < 0.001）。RT-qPCR结果显示，在A549和H1299细胞中，与阴性对照相比，转染miR-582-3p模拟物后miR-582-3p表达显著增加（n = 4, P < 0.01）。OE组中PTPRCAP表达显著高于Vector组（n = 4, P < 0.001）。这表明过表达模型在肺腺癌细胞系A549和H1299中成功构建。转染过表达质粒后，Western blot结果显示，两种细胞中OE组PTPRCAP蛋白表达显著高于Vector组（n = 3, P < 0.001）。总之，这些发现表明各组过表达模型已在A549和H1299细胞系中稳定构建，可用于后续实验。

上调miR-582-3p对肺腺癌A549和H1299细胞增殖、迁移和侵袭的影响

转染miR-582-3p模拟物或阴性对照miRNA（miR-NC）后，A549和H1299细胞分别分配至miR-582-3p和miR-NC组。进行一系列功能测定，包括CCK-8增殖、伤口愈合、Transwell迁移和侵袭以及流式细胞术凋亡分析，以评估miR-582-3p的致癌作用。CCK-8实验显示，与miR-NC组相比，miR-582-3p组在A549和H1299细胞中的增殖能力显著增强（n = 3, P < 0.001）。一致地，伤口愈合实验证明miR-582-3p转染细胞的迁移能力显著增加（n = 6, P < 0.001）。此外，Transwell实验证实迁移和侵袭能力均显著促进，miR-582-3p组迁移和侵袭细胞数量增加证明（n = 5, P < 0.001）。总之，这些结果表明miR-582-3p通过促进肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭作为oncomiR发挥作用。

过表达PTPRCAP对肺腺癌A549和H1299细胞增殖、迁移和侵袭的影响

功能表型测定证实了PTPRCAP在肺腺癌细胞中的显著肿瘤抑制作用。建立稳定的PTPRCAP过表达细胞系后，功能分析显示，与空载体对照（Vector）组相比，PTPRCAP过表达显著抑制了A549和H1299细胞的恶性表型。具体而言，CCK-8增殖实验证明72小时后细胞活力显著降低，A549和H1299细胞的OD值分别降低64%和60%（n = 3；均P < 0.01）。伤口愈合实验显示，两种细胞系的24小时伤口闭合率分别降低50%和57%（n = 6；均P < 0.001）。此外，Transwell实验表明迁移细胞数量减少34%和37%，而侵袭细胞数量分别减少42%和50%（n = 4；均P < 0.01）。

上调miR-582-3p对PTPRCAP蛋白和Wnt/β-catenin通路蛋白表达的影响

为研究miR-582-3p上调的功能影响，我们通过Western blot分析评估了PTPRCAP和Wnt/β-catenin信号通路关键组分（包括GSK3β、p-GSK3β和β-catenin）的蛋白表达。miR-582-3p过表达后，两种肺腺癌细胞系A549和H1299中PTPRCAP蛋白水平显著降低。这种下调在H1299细胞中更为明显（降低80%, n = 3, P < 0.001） than in A549 cells (降低20%, n = 3, P = 0.030)。此外，miR-582-3p上调导致GSK3β蛋白表达降低，同时其磷酸化形式（p-GSK3β）和β-catenin水平在两种细胞系中增加，β-catenin积累变化最为显著。定量分析显示，在A549细胞中，GSK3β表达减少17%（n = 9, P = 0.004），而p-GSK3β和β-catenin水平分别增加20%（n = 9, P = 0.011）和115%（n = 9, P < 0.0001）。类似地，在H1299细胞中，GSK3β表达减少25%（n = 9, P = 0.002），而p-GSK3β和β-catenin水平分别增加23%（n = 9, P = 0.005）和80%（n = 9, P < 0.0001）。总之，这些结果表明miR-582-3p介导的PTPRCAP调控可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路发挥作用。

过表达PTPRCAP对Wnt/β-catenin通路蛋白表达的影响

为研究PTPRCAP在Wnt/β-catenin信号通路中的调控作用，我们通过Western blot分析检测了PTPRCAP过表达后关键通路组分—GSK3β、p-GSK3β和β-catenin—的蛋白表达水平。结果表明，肺腺癌A549和H1299细胞中PTPRCAP过表达显著增加GSK3β表达，同时降低p-GSK3β和β-catenin水平。具体而言，在A549细胞中，GSK3β蛋白水平升高23%（n = 3, P = 0.001），而p-GSK3β和β-catenin分别减少22%（n = 3, P = 0.001）和31%（n = 3, P < 0.0001）。类似地，在H1299细胞中，GSK3β表达增加23%（n = 3, P = 0.008），而p-GSK3β和β-catenin水平分别降低43%（n = 3, P < 0.0001）和22%（n = 3, P = 0.011）。这些发现表明，PTPRCAP可能通过上调GSK3β表达、抑制其磷酸化并 consequently促进β-catenin降解来抑制Wnt/β-catenin通路的激活。该机制可能代表PTPRCAP肿瘤抑制功能的一个关键方面。

共转染miR-582-3p模拟物和PTPRCAP质粒对肺腺癌A549和H1299细胞增殖、迁移和侵袭的影响

进行救援实验以研究PTPRCAP过表达是否可以