探究Arthrocolins（Acs）对广泛耐药铜绿假单胞菌的抗菌潜力：氨基酸代谢干扰的机制解析

本研究系统评估了新型荧光素类化合物Arthrocolins（Acs）对广泛耐药铜绿假单胞菌（XDR-PA）的抗菌活性及作用机制。通过临床数据分析、药敏试验、透射电镜（TEM）及多组学技术，发现Acs通过干扰氨基酸代谢通路，破坏能量代谢（ATP水平显著降低）并引发脂质异常积累，最终导致细胞结构崩解。其IC50值低至3.094?μM，展现出显著治疗潜力，为XDR-PA感染提供了新型代谢靶向治疗策略。

　　

引言

根据世界卫生组织2024年细菌优先病原体清单，碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌（CRPA）因其高发的多重耐药/广泛耐药（MDR/XDR）表型及有效治疗手段的匮乏，被列为最高级别威胁。近年来流行病学研究显示，铜绿假单胞菌在全球范围内造成显著感染负担，尤其在呼吸道标本中呈现高定植率、高感染率及高复发率特点。医疗暴露和既往抗生素使用是耐药性发展的关键风险因素。高危人群如住院患者、烧伤患者、儿童以及血液系统恶性肿瘤患者，更易遭受MDR/XDR铜绿假单胞菌感染，并伴随高发病率及死亡率。

尽管多粘菌素（如colistin）长期被视为最后一道防线，但其临床应用受限于严重肾毒性及治疗结果的不一致性。新型β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合（如ceftolozane–tazobactam）虽扩展了治疗选择，但敏感性在不同耐药背景下仍存在异质性。这些局限性共同凸显了当前治疗领域的空白。

荧光素类arthrocolins（Acs）是近年发现的一类天然产物，可在工程化大肠杆菌中生物合成。除抗菌特性外，Acs还表现出与氟康唑协同抗耐药白色念珠菌的活性，通过增强核黄素代谢诱导线粒体功能障碍和自噬。这些发现表明Acs具有多方面的生物活性，值得进一步评估其作为抗菌剂的潜力。

材料与方法

本研究从云南大学附属医院住院患者中收集了228株非重复广泛耐药铜绿假单胞菌（XDR-PA）分离株，经16S rRNA测序确认菌种。所有实验均遵循标准方案，每组实验重复三次。Arthrocolins（Acs）由云南大学微生物资源教育部重点实验室提供，纯度高于95%。药敏试验使用VITEK?2?COMPACT系统进行，参考临床与实验室标准协会（CLSI?M100第32版）指南。

从中选取一株具有MLST亚型ST3390的代表性菌株（从住院患者尿液中分离）用于后续IC₅₀测定、透射电镜观察、转录组测序和代谢组学分析。IC₅₀通过微孔板稀释法测定，细菌浓度调整为1×10⁵?CFU/mL，Acs浓度范围为0–8?μM。透射电镜样品经戊二醛固定、锇酸后固定、乙醇梯度脱水及树脂包埋后，使用JEM-1400透射电镜观察。

细胞内ATP水平采用ATP含量检测试剂盒（Solarbio）通过荧光素酶化学发光法测定。细胞内脂质含量使用脂质荧光试剂（Abcam）染色，通过流式细胞术在490/585?nm波长下检测荧光强度。

转录组测序在Illumina?NextSeq?500平台上进行，使用RSEM软件量化基因丰度，差异表达基因通过GO和KEGG富集分析。代谢组学分析采用非靶向方法，在METABOLON’s?Discovery?HD4?平台上完成，使用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）和变量投影重要性（VIP）筛选差异代谢物。

结果

临床特征与耐药谱分析

2018年12月至2023年6月期间，共从2533株独特细菌分离株中鉴定出250株XDR-PA，最终确认228例XDR-PA感染，检出率为9.0%。回归分析显示，抗菌药物使用天数、住院时间、临床治疗超过1个月、气管插管和导尿管留置是XDR-PA感染的显著风险因素。

药敏测试显示，2533株铜绿假单胞菌对12种抗生素的耐药率分别为：SCF（19.8%）、PIP（24.7%）、TZP（19.5%）、CAZ（20.9%）、FEP（11.1%）、ATM（24.1%）、IPM（29.6%）、MEM（21.4%）、AK（7.1%）、TCC（30.1%）、CIP（13.3%）和LEV（15.2%）。

Acs的抗菌效应

以ST339型代表菌株为对象，Acs在0.5–8?μM浓度范围内表现出显著抑菌效果，IC₅₀值为3.094?μM。与常用抗生素如meropenem和ceftazidime相比，Acs在较低浓度（1–8?μM）下即表现出相当或更优的活性。

Acs引起代谢紊乱

透射电镜显示，未经Acs处理的XDR-PA细胞壁完整，细胞质丰富；经3.094?μM?Acs处理后，细胞壁模糊，胞质凝集成簇，细胞器分布不清。同时，ATP水平显著降低（p?

转录组学分析

Acs处理组与对照组相比，共有36个基因上调和19个基因下调。GO富集分析显示，最显著的通路包括有机氮化合物分解代谢过程、细胞修饰氨基酸分解代谢过程、细胞分解过程等。KEGG分析提示，甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、酪氨酸代谢、缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸降解等氨基酸代谢通路显著富集。

代谢组学特征

共鉴定出460种代谢物，其中108种存在差异表达（39种上调，69种下调）。KEGG通路富集分析显示，鞘脂信号通路、柠檬酸循环、β-丙氨酸代谢等发生显著改变。相关性分析进一步表明，氨基酸代谢和膜运输通路具有高差异丰度评分和较多相关代谢物。

讨论

本研究结果表明，Acs通过浓度依赖性方式抑制XDR-PA生长，并引起显著的代谢和结构扰动。多组学数据支持Acs主要通过干扰氨基酸代谢通路发挥作用，进而影响能量生产和细胞完整性，最终导致细菌死亡。

氨基酸代谢在细菌能量产生、细胞组分合成及内环境稳定中起核心作用。支链氨基酸（BCAAs）与葡萄糖转运蛋白转位密切相关，其可用性或通量的扰动会降低细胞能量电荷。此外，氨基酸代谢紊乱可引发应激反应和生物能量缺陷，并通过三羧酸循环（TCA）整合氧化还原和氨基酸信号传导。

代谢组学数据还提示鞘脂相关中间体发生改变，尽管细菌鞘脂种类较真核生物有限，但脂质中间体的变化可能影响膜组织、氧化还原平衡和信号传导，与氨基酸通路形成交叉对话。

当前XDR-PA的治疗方案仍不完善，而Acs通过代谢干扰而非经典靶点（如细胞壁、核糖体或DNA）发挥作用，提示其可能规避现有耐药机制，并与现有药物产生协同效应。

研究局限与展望

本研究存在若干局限：Acs的精确分子靶点尚未确定；评价仅针对单一XDR分离株，需在更多高危克隆（如ST235）中验证；缺乏体内数据，需通过动物感染模型验证疗效与安全性；未评估Acs对哺乳动物细胞的潜在毒性。这些局限为后续机制阐明和临床前开发指明了方向。

结论

Acs作为有潜力的代谢干扰剂，对XDR铜绿假单胞菌表现出强效抗菌活性。通过将化学结构与代谢脆弱性相联系，本研究为干扰氨基酸中心通路以削弱细菌存活力的机制提供了证据。将这一发现置于耐药调控和新兴治疗策略的大背景下，凸显了Acs的转化潜力。未来的研究有望推动Acs进入临床前开发，并纳入针对多药耐药病原体的治疗武器库。